Page 75 - 《中国药房》2024年8期

3.3 自噬激活对仑伐替尼耐药的逆转作用 10 7.2 10 7.2
Western blot 实验结果（图 7）显示，与 Huh7 组比较， 10 6 10 6
10 5 10 5
Huh7-LR 组细胞中 p62 蛋白的表达水平显著升高（P＜
PI 10 4 PI 10 4
0.05）；与 Huh7-LR 组比较，Huh7-LR+starv 组细胞中 p62 10 3 10 3
蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）。GFP-mCherry- 10 2 10 2
LC3质粒转染实验结果（图8）显示，Huh7-LR+starv组细 10 1 10 1
10 10 10 10 10 10 10 7.2 10 10 10 10 10 10 10 7.2
2
1
1
4
5
6
2
3
5
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3
4
胞的红色、黄色荧光斑点均较 Huh7-LR 组增多，提示饥 Annexin Ⅴ-FITC Annexin Ⅴ-FITC
A. Huh7组 B. Huh7-LR组
饿处理能诱导 Huh7-LR 细胞自噬激活。流式细胞术实
10 7.2
验结果（图 9）显示，经 10 μmol/L 仑伐替尼作用 24 h 后， 10 6
Huh7-LR 组细胞的凋亡率为（1.20±0.10）%，显著低于 10 5
Huh7 组细胞的（33.20±2.24）%（P＜0.05）；而 Huh7-LR+ PI 10 4
10 3
starv组细胞的凋亡率为（5.24±1.85）%，显著高于Huh7-
10 2
LR 组细胞（P＜0.05）。上述结果提示，自噬激活能够提
10 1
5
4
高耐药细胞对仑伐替尼的敏感性。 10 10 10 10 10 10 10 7.2
6
2
1
3
Annexin Ⅴ-FITC
2.5 C. Huh7-LR+starv组
a
2.0 图9 自噬激活实验中各组细胞对仑伐替尼的敏感性
蛋白表达水平 1.5 b 力军 。然而临床实践显示，仑伐替尼的耐药问题逐渐
[3]
p62 62 kDa 1.0
[3]
0.5 成为限制其临床应用的一大原因 。研究指出，仑伐替
GAPDH 37 kDa
0 尼 耐 药 受 EGFR 活 化 、c-Met 信 号 失 调 等 机 制 的 调
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅲ
A.蛋白电泳图 B.蛋白表达柱形图（x±s，n＝3） 控 [16―17] 。探讨仑伐替尼耐药机制，寻找关键信号通路或
Ⅰ：Huh7组；Ⅱ：Huh7-LR组；Ⅲ：Huh7-LR+starv组；a：与Huh7组比 作用靶点，有助于为逆转仑伐替尼耐药或减轻耐药程度
较，P＜0.05；b：与Huh7-LR组比较，P＜0.05。
图7 自噬激活实验中各组细胞中p62蛋白的表达情况 提供新靶点、新策略，切实改善患者治疗结局。
本研究采用低浓度逐渐递增联合长期给药的方式
构建 Huh7-LR 细胞模型，通过显微观察和细胞抑制率、
GFP 凋亡率检测来验证耐药细胞对仑伐替尼的敏感性，并通
100 μm 100 μm 100 μm 过 Western blot 实验和 GFP-mCherry-LC3 转染实验来综
合评价细胞自噬水平。自噬关键蛋白 Beclin-1、p62、
mCherry LC3是反映自噬激活或抑制状态的重要指标：当Beclin-1
蛋白表达下调、p62蛋白表达上调时，则预示细胞自噬受
100 μm 100 μm 100 μm [9]
到抑制 ；此外，自噬小体的膜变化过程伴随着LC3表达
形式的转化，即胞浆型 LC3（LC3Ⅰ）可与磷脂酰乙醇胺
合并 共价结合，转化成膜型LC3（LC3Ⅱ），后者的增多可能源
于自噬小体膜生成的增多，也有可能是自噬流受阻引发
100 μm 100 μm 100 μm
A. Huh7组 B. Huh7-LR组 C. Huh7-LR+starv组 代谢累积的结果 [18―19] 。基于此，本研究以 Beclin-1、p62
图8 自噬激活实验中各组细胞的自噬水平 蛋白的表达情况和 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值来反映细胞自噬
4 讨论 状态。结果显示，与亲本细胞相比，Huh7-LR 细胞的耐
HCC 是高复发、难治愈的恶性肿瘤之一，患者的 5 药指数为6.2，边缘不规则且触角增多，凋亡率和LC3Ⅱ/
年生存率仅为18% 。中晚期肝癌患者的首选治疗药物 LC3Ⅰ比值、Beclin-1 蛋白的表达水平均显著降低，p62
[2]
[15]
以多激酶抑制剂为主，包括索拉非尼、仑伐替尼等 。 蛋白的表达水平显著升高，同时结合GFP-mCherry-LC3
其中，仑伐替尼具有独特的分子靶点（包括血管内皮生 转染实验结果可知，Huh7-LR细胞的自噬水平较亲本细
长因子受体 1～3、血小板衍生生长因子受体、成纤维细 胞明显下降。
胞生长因子受体 1～4 等），并因不低于索拉非尼的生存 为进一步探究自噬在仑伐替尼耐药中的作用，本研
期及相对可控的耐受性等优势成为肝癌一线治疗的主 究通过饥饿诱导自噬激活，观察自噬对仑伐替尼耐药性

中国药房 2024年第35卷第8期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 8 · 965 ·