Page 74 - 《中国药房》2024年8期

完全培养基中进行饥饿处理 6 h。收集各组细胞，按 10 7.2 10 7.2
10 6 10 6
“2.3.1”项下方法检测其中 p62 蛋白的表达情况；按
10 5 10 5
“2.3.2”项下方法进行转染处理，待转染细胞生长稳定 PI 10 4 PI 10 4
后，使用荧光显微镜观察其自噬情况；按“2.2.2（3）”项下 10 3 10 3
10 2 10 2
方法，以10 μmol/L的仑伐替尼干预24 h后，检测细胞凋
10 1 10 1
亡情况。 10 10 10 10 10 10 10 7.2 10 10 10 10 10 10 10 7.2
4
5
6
1
2
3
1
5
6
4
2
3
2.5 统计学方法 Annexin Ⅴ-FITC Annexin Ⅴ-FITC
A. Huh7细胞 B. Huh7-LR细胞
采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。结果数 图4 Huh7 和 Huh7-LR 细胞对仑伐替尼的敏感性（流
据以x±s表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用 式细胞术实验）
单因素方差分析和Tukey事后检验。检验水准α＝0.05。
3 结果 Beclin-1蛋白的表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均显著降
3.1 仑伐替尼耐药株的鉴定结果 低（P＜0.05 或 P＜0.01）。GFP-mCherry-LC3 质粒转染
显微观察结果（图2）显示，与亲本细胞（Huh7细胞） 实验结果（图 6）显示，与 Huh7 细胞比较，Huh7-LR 细胞
相比，仑伐替尼耐药细胞（Huh7-LR细胞）边缘不规则且 中的红色、黄色荧光斑点均有所减少。以上结果提示，
触角增多，形态改变明显。CCK-8实验结果（图3）表明， 相较于Huh7细胞，Huh7-LR细胞的自噬水平降低。
仑伐替尼对 Huh7 细胞的 IC50 为 25.9 μmol/L，对 Huh7- 1.5 a Huh7细胞
p62 62 kDa
LR细胞的IC50为160.7 μmol/L，耐药指数为6.2。流式细 Huh7-LR细胞
胞术实验结果（图4）显示，经10 μmol/L的仑伐替尼干预 Beclin-1 60 kDa 1.0 b a
24 h 后，Huh7-LR 细胞的凋亡率为（7.45±2.67）%，显著 LC3Ⅰ 14 kDa 蛋白表达水平
LC3Ⅱ 16 kDa 0.5
低于Huh7细胞的（41.38±0.59）%（P＜0.01）。上述结果
表明，仑伐替尼耐药细胞 Huh7-LR 可稳定生长于含 10 GAPDH 37 kDa 0
Huh7细胞 Huh7-LR细胞 p62 Beclin-1 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ
μmol/L仑伐替尼的完全培养基中；该细胞株对仑伐替尼
A.蛋白表达电泳图 B.蛋白表达柱形图（x±s，n＝3）
的敏感性低于亲本细胞，具有明显的耐药性。 a：与Huh7细胞比较，P＜0.01；b：与Huh7细胞比较，P＜0.05。
图5 2种细胞中Beclin-1、p62、LC3蛋白的表达情况

GFP
100 μm 100 μm
A. Huh7细胞 B. Huh7-LR细胞
100 μm 100 μm
图2 Huh7和Huh7-LR细胞外观形态的显微图
100 80
80 60
细胞抑制率/% 60 细胞抑制率/% 40 mCherry
40
20
20
0 0 100 μm 100 μm
0 1 2 3 0 1 2 3
仑伐替尼浓度对数值 仑伐替尼浓度对数值
A. Huh7细胞 B. Huh7-LR细胞
图3 Huh7 和 Huh7-LR 细 胞 对 仑 伐 替 尼 的 敏 感 性
（CCK-8实验）
合并
3.2 2 种细胞中 Beclin-1、p62、LC3 蛋白表达和自噬水
平的检测结果
100 μm 100 μm
Western blot 实验结果（图 5）显示，与 Huh7 细胞比 A. Huh7细胞 B. Huh7-LR细胞
较，Huh7-LR 细胞中 p62 蛋白的表达水平显著升高， 图6 2种细胞的自噬水平

· 964 · China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 8 中国药房 2024年第35卷第8期