Page 73 - 《中国药房》2024年8期
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有效工作浓度。选取生长状态良好的 Huh7 细胞，采用                        2.3 Huh7和Huh7-LR细胞自噬水平检测
          低浓度逐渐递增联合长期给药的方式构建仑伐替尼耐                                分别采用 Western blot 实验和 GFP-mCherry-LC3 质
          药（Huh7-lenvatinib resistance，Huh7-LR）模型，具体流程       粒转染实验检测细胞中自噬相关蛋白的表达情况和细
         （图 1）如下：待 Huh7 细胞生长融合至 50%～60% 时，用                  胞自噬水平。

          含1 μmol/L仑伐替尼的完全培养基首次干预24 h；弃去                     2.3.1 细胞中自噬相关蛋白表达
          培养基，更换为完全培养基；待细胞长满后传代并继续                               取生长状态良好且处于对数生长期的 Huh7 及
          以含药培养基和完全培养基交替培养，2～3个循环后再                          Huh7-LR 细胞，以 5×10 个/孔接种于 6 孔板中（每种细
                                                                                  5
          次传代；取传代后的细胞，用含 2 μmol/L 仑伐替尼的完                     胞设置 3 个复孔），培养 24 h。收集 2 种细胞，用磷酸盐
          全培养基干预，再次进行含药培养基及完全培养基的交                           缓冲液（PBS）清洗 2 次，加入含蛋白磷酸酶抑制剂的
          替培养，并同法继续提高药物浓度至 10 μmol/L，即得                      RIPA裂解液适量，于冰上裂解15 min；取裂解液，于4 ℃
          Huh7-LR 细胞模型（通过显微观察细胞形态和 CCK-8、                    下以12 000 r/min离心15 min，取蛋白上清液，加入上样
          流式细胞术实验评价细胞对仑伐替尼的敏感性来判定，                           缓冲液适量，于 100 ℃金属浴中加热 10 min 变性；取变
          具体实验内容见“2.2.2”项）。将所得耐药株继续培养于                       性蛋白适量，经SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜上，于
          含 10 μmol/L 仑伐替尼的完全培养基中以维持其耐药                      室温下以快速封闭液封闭 10 min；用 TBST 缓冲液洗膜
          特性。                                                后，加入 Beclin-1、p62、LC3、GAPDH 一抗（稀释比例均
                                                             为 1∶1 000），4 ℃下孵育过夜；用 TBST 缓冲液洗膜后，
                  1 μmol/L仑伐替尼+  2 μmol/L仑伐替尼+  3 μmol/L仑伐替尼+
                   完全培养基     完全培养基     完全培养基                 加入相应二抗（稀释比例均为1∶5 000），室温下孵育1 h；
                                                             用TBST缓冲液洗膜后，经ECL显影、成像。使用Image
                                                Huh7-LR细胞
           Huh7细胞                            （10 μmol/L仑伐替尼）  J软件进行分析，以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的条
            图1 仑伐替尼耐药的Huh7-LR细胞构建流程图                         带灰度值比值表示目的蛋白的表达水平，结果以 Huh7

          2.2.2 Huh7-LR细胞模型验证                                细胞为参照进行归一化处理。
             （1）显微观察：取 Huh7 和 Huh7-LR 细胞，使用显微                2.3.2 细胞自噬水平
          镜观察其外观形态。                                              取生长状态良好且处于对数生长期的 Huh7 和
                                                                                 5
             （2）CCK-8 实验：取生长状态良好且处于对数生长                      Huh7-LR细胞，以1×10 个/孔接种于12孔板中（每种细
          期的 Huh7 和 Huh7-LR 细胞，以 5 000 个/孔接种于 96 孔           胞设置 3 个复孔），培养 24 h。待 2 种细胞生长融合至
          板中。待细胞生长融合至 60%～70% 时，分为对照组                        40%～50% 时，弃去培养基；加入 Opti-MEM 培养基，培
         （含培养基但不含药物）及梯度药物干预组（含培养基和                           养 2 h 后进行 GFP-mCherry-LC3 质粒转染。转染时，将
          2、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L 的仑伐替尼，药物浓            质粒溶解于适量 Opti-MEM 培养基中，并与 Lipo2000 转
          度参考预实验结果设定），并设置不含细胞、不含药物的                          染试剂混合均匀，静置 15 min 后，将上述转染复合物分
          空白组，每组设置6个复孔。作用24 h后，弃去培养基，                        别加至Huh7和Huh7-LR细胞中；转染6～8 h后，弃去培
          每孔加入CCK-8试剂适量，孵育1 h后，使用酶标仪检测                       养基，以完全培养基继续培养24～28 h。待转染细胞生
          各孔光密度（OD）值，计算细胞抑制率{细胞抑制率＝                          长稳定（可见荧光）后，使用荧光显微镜观察2种细胞的
          [1－（实验组OD值－空白组OD值）/（对照组OD值－空                       自噬情况（正常细胞呈现黄色荧光；若细胞红色、黄色荧
          白组 OD 值）]×100%}和半数抑制浓度（IC50 ），并计算耐                 光斑点点状聚集增加，提示细胞自噬水平增强）。
          药指数（耐药指数＝耐药细胞IC50/亲本细胞IC50 ）。                      2.4 自噬激活对仑伐替尼耐药逆转作用的检测
             （3）流式细胞术实验：取生长状态良好且处于对数                             为进一步明确自噬在仑伐替尼耐药中的作用，

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          生长期的 Huh7 和 Huh7-LR 细胞，以 5×10 个/孔接种于               本研究借助无血清培养基致饥饿环境诱发自噬激活
                                                                    [14]
          6孔板中，培养24 h。待细胞生长融合至60%～70%时，                      的 方 式 ，考 察 自 噬 激 活 对 仑 伐 替 尼 耐 药 的 逆 转
          分别用 10 μmol/L 的仑伐替尼干预，每种细胞设置 3 个                   作用。
          复孔。作用24 h后，收集细胞，经胰酶消化后，用流式缓                            取生长状态良好且处于对数生长期的 Huh7 和
          冲液重悬，依次加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染料适量，混                   Huh7-LR 细胞，分为对照组（Huh7 组）、耐药细胞组
          匀后避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测各组细胞的                       （Huh7-LR 组）、耐药细胞饥饿组（Huh7-LR+starv 组），每
          凋亡情况。                                              组设置 3 个复孔。Huh7-LR+starv 组细胞在不含血清的


          中国药房  2024年第35卷第8期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 8    · 963 ·
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