Page 72 - 《中国药房》2024年8期
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癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作为常见的原发性肝            Annexin  Ⅴ -FITC/PI 细 胞 凋 亡 检 测 试 剂 盒（批 号
          癌组织学类型，具有发病隐匿、转移快、易复发等特点，                           0076884）购自美国BD公司；Trizol总RNA提取试剂（批
          其临床治疗以外科切除、肝移植及射频消融、化疗、口服                           号 5596-026）、Lipofectamine 2000（Lipo2000）转染试剂
          多激酶抑制剂等为主 。其中，索拉非尼等多激酶抑制                           （批号 11668-019）均购自美国 Invitrogen 公司；胎牛血清
                             [2]
          剂是中晚期肝癌患者的首选治疗方案。2018年，仑伐替                         （FBS，批 号 10099-141）、DMEM 高 糖 培 养 基（批 号
          尼在我国获批成为最新的肝癌一线治疗药物，打破了同                            C11995500BT）、Opti-MEM培养基（批号31985070）均购
          类药物索拉非尼在肝癌治疗领域近10年的垄断局面 。                           自美国 Gibco 公司；胰蛋白酶消化液（批号 C100C1）、
                                                        [3]
          然而，随着仑伐替尼、索拉非尼等HCC全身性治疗药物                           100×青霉素-链霉素溶液（批号C100C5）、蛋白磷酸酶抑
          临床应用的日益广泛，其有效性受到靶信号通路相关分                            制剂混合物（批号 P002）、RIPA 裂解液（批号 WB3100）、
          子的干扰；同时，由于HCC的遗传异质性，以及Hippo、c-                      彩色预染蛋白marker（批号P9005）、5×蛋白上样缓冲液
          Myc等经典信号通路和N6-腺苷酸甲基化修饰等经典生                         （批号 WB2001）、10×TBST 缓冲液（批号 WB20500）、
          物学行为的影响，其耐药问题日渐突显                 [4―6] 。因此，探讨      BCA蛋白定量试剂盒（批号WB6501）、极敏ECL化学发
          仑伐替尼耐药机制，寻找逆转或减轻耐药的有效方法对                            光试剂盒（批号 P10060）、快速封闭液（批号 P30500）均
          仑伐替尼的临床应用至关重要。                                      购自苏州新赛美生物科技有限公司；10%十二烷基硫酸
              自噬是一种细胞自我降解和胞内组分循环利用的                           钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）快速制备试剂盒
          过程，可参与细胞或机体营养物质的降解回收、细胞微                           （批号PG112）、10×SDS电泳缓冲液（批号PS105）、10×
          环境稳态的维持和肿瘤的发生发展，并可通过信号通路                            转膜缓冲液（批号PS109）均购自上海雅酶生物医药科技
          改变等途径来发挥耐药调控作用               [7―9] 。研究指出，自噬         有限公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（批号 IPVH00010）

          在肿瘤细胞耐药过程中的作用具有两面性：一方面，自                            购自美国 Millipore 公司；兔源自噬接头蛋白 sequesto‐
          噬信号通路被激活后能够分解药物分子，促进细胞存活                            some 1（SQSTM1，又名 p62）、自噬效应蛋白 Beclin-1、微
          并产生药物抵抗，如激活自噬能够增强肝癌细胞对奥沙                            管 相 关 蛋 白 1 轻 链 3（microtubule-associated  protein  1
          利铂、索拉非尼等药物的耐药性；另一方面，激活自噬能                           light chain 3，LC3）单克隆抗体和鼠源甘油醛-3-磷酸脱
          增强肿瘤细胞对表皮生长因子受体（epidermal growth                    氢酶（GAPDH）单克隆抗体（批号分别为#23214、#3495、
          factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂类药物的敏感                 #12741、#97166）均购自美国CST公司；辣根过氧化物酶
          性 [10―11] 。在仑伐替尼耐药方面，毒性自噬小体的生成与                    （HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗和HRP标
                                       [12]
          该药细胞毒作用的发挥密切相关 ，由腺苷一磷酸活化                            记 的 羊 抗 鼠 IgG 二 抗（ 批 号 分 别 为 abs20002ss、
          蛋白激酶信号通路介导的自噬激活途径能够提高肝癌                             abs20039ss）均购自爱必信（上海）生物科技有限公司；
                                 [13]
          细胞对仑伐替尼的敏感性 。由此可见，自噬可能在肝                            GFP-mCherry-LC3 质粒购自上海和元生物技术有限
          癌细胞对仑伐替尼耐药的发生过程中具有关键作用。                             公司。
          基于此，本研究通过构建仑伐替尼耐药体外人源肝癌细                            1.3 细胞
          胞模型，探究自噬与仑伐替尼耐药的相关性，以期为该                                人肝癌细胞株Huh7来自中国科学院生物化学与细
          药耐药机制的进一步探索提供科学依据。                                  胞生物学研究所，于－80 ℃下冻存。
          1 材料                                                2 方法
          1.1 主要仪器                                            2.1 细胞复苏及培养
              本研究使用的主要仪器包括 BB150 型细胞培养箱                           取冻存的 Huh7 细胞，于 37 ℃下融化、复苏。待细
         （美国 Thermo Fisher Scientific 公司）、DMI8 型倒置荧光          胞融化后，加入等体积的完全培养基（即含10%FBS、1%
          显微镜（德国 Leica 公司）、Epoch 2t 型全波长酶标仪（美                 青霉素-链霉素溶液的 DMEM 高糖培养基，下同）混合，
          国 BioTek 公司）、Accuri C6 型流式细胞仪（美国 BD 公               以1 000 r/min离心3 min；收集细胞，使用完全培养基重
          司）、Tannon 5200 型化学发光成像系统（上海天能科技                     悬并接种于完全培养基8～10 mL中，轻轻晃动，混匀后
                                   ®
          有限公司）、Mini-PROTEAN  Tetra 型电泳系统（美国                  置于37 ℃、5%CO2条件下培养。
          Bio-Rad公司）等。                                        2.2 仑伐替尼耐药株构建及验证
          1.2 主要药品与试剂                                         2.2.1 仑伐替尼耐药株构建
              仑伐替尼原料药（批号 HY-10981，纯度≥99.0%）、                      将仑伐替尼溶解于适量二甲基亚砜中，于－80 ℃下
          CCK-8试剂盒（批号HY-K0301）均购自美国MCE公司；                     避光保存。临用前，使用完全培养基将上述药液稀释至


          · 962 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 8                               中国药房  2024年第35卷第8期
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