Page 50 - 《中国药房》2024年8期
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给药剂量依据相应试剂盒要求设置）；模型组和正常组                            2.7 大鼠海马组织中 CREB/BDNF 信号通路相关蛋白
          大鼠灌胃等体积生理盐水；每天1次，连续4周。给药期                           表达检测
          间，正常组大鼠以普通饲料喂养，其余各组大鼠以高脂                                取冻存的各组大鼠海马组织适量，研磨后加入蛋白
          高糖饲料喂养，且不再给予应激刺激。                                   裂解液，充分振荡混匀，加入蛋白提取液，静置5 min，于
          2.2 大鼠空腹血糖检测及抑郁症状评估                                 4 ℃下以 1 500 r/min 离心 5 min，收集上清液；取适量上
              末次给药后 24 h，检测各组大鼠空腹血糖值，然后                       清液（200 μL）与上样缓冲液混合后加热变性，然后取变
          进行强迫游泳实验及悬尾实验以评估大鼠抑郁症状。                             性蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分
         （1）强迫游泳实验：实验用水桶高为 50 cm，直径为 30                       离 ，转 膜 后 ，以 5% 脱 脂 奶 粉 封 闭 2  h；加 入 CREB、
                                                              BDNF、GAPDH一抗（稀释度均为1∶1 100），4 ℃孵育过
          cm，向桶中加入清水（水深为30 cm，水温保持22 ℃），将
                                                              夜；弃去封闭液，用 TBST 缓冲液清洗 5 min×3 次，加入
          各组大鼠放于水中，确保其前肢不依附桶壁，后肢不依
                                                              相应二抗（稀释度为 1∶1 650），常温孵育 30 min；用
          靠桶底支撑，游泳5 min，利用影像记录各组大鼠的不动
                                                              TBST 缓冲液清洗 5 min×3 次，用发光染色液浸泡染色
          时间。（2）悬尾实验：大鼠尾部悬挂置于高 50 cm 的空间
                                                              60 s，取出后吸去多余水分，置于凝胶成像系统上成像，
          内，确保其不能通过四肢接触物体，持续悬挂 6 min，利
                                                              以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的条带灰度值比值表
          用影像记录各组大鼠的不动时间。大鼠上述实验不动
                                                              示目的蛋白的表达水平。
          时间越长表示抑郁症状越严重。
                                                              2.8 统计学方法
          2.3 大鼠血清中CORT和炎症因子水平检测
                                                                  采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。数据以
              上述行为学实验完成后，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠                          x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两
         （50 mg/kg）麻醉，于腹主动脉取血，离心后分离血清，采                       两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          用ELISA法检测大鼠血清中CORT和炎症因子（TNF-α、                      3 结果
          IL-1β、IL-6）水平。                                      3.1 姜黄素对模型大鼠空腹血糖及抑郁症状的影响
          2.4 大鼠海马组织中NE、5-HT水平检测                                  与正常组相比，模型组大鼠的空腹血糖、强迫游泳
              取血完成后，处死大鼠，迅速取脑并分离海马组织，                         不动时间、悬尾不动时间均显著升高或延长（P＜0.05）。
          将部分海马组织置于 4% 多聚甲醛中固定，部分用液氮                          与模型组相比，阳性对照组和姜黄素低、高剂量组大鼠
          处理后置于－70 ℃冰箱中保存备用；剩余海马组织制成                          的空腹血糖、强迫游泳不动时间、悬尾不动时间均显著
          组织匀浆，离心后取上清液，采用 ELISA 法检测大鼠海                        降低或缩短（P＜0.05）；且姜黄素高剂量组大鼠上述指
          马组织中NE、5-HT水平。                                      标均显著低于或短于姜黄素低剂量组（P＜0.05）。与姜
          2.5 大鼠海马组织病理学观察及神经元凋亡检测                             黄素高剂量组相比，姜黄素高剂量+CREB抑制剂组大鼠
              取在 4% 多聚甲醛中固定 24 h 的各组大鼠海马组                     的空腹血糖、强迫游泳不动时间、悬尾不动时间均显著
          织，以不同体积分数乙醇梯度脱水，经二甲苯透明后制                            升高或延长（P＜0.05）。结果见表1。
          作常规石蜡切片（厚度 4 μm），脱蜡至水后按照相应试                         表1 各组大鼠空腹血糖、强迫游泳不动时间、悬尾不动
          剂盒说明书方法分别进行 Nissl 染色、TUNEL 染色。随                          时间比较（x±s，n＝12）
          机选取5个视野，分别记录存活神经元数和凋亡神经元                            组别              空腹血糖/（mmol/L）  强迫游泳不动时间/s  悬尾不动时间/s
          数（均取平均值），计算凋亡指数（凋亡指数＝凋亡神经                           正常组               4.51±0.31  61.25±4.26  76.63±5.52
                                                              模型组               18.15±0.41 a  170.63±7.83 a  188.25±7.26 a
          元数/神经元总数×100%）。                                     阳性对照组             7.82±0.52 b  102.66±7.52 b  114.62±6.63 b
          2.6 大鼠海马组织中CREB、BDNF mRNA水平检测                       姜黄素低剂量组           12.16±0.47 b  126.62±6.26 b  147.52±7.63 b
              取冻存的各组大鼠海马组织适量，通过 Trizol 法提                     姜黄素高剂量组           8.08±0.56 bc  104.34±6.63 bc  118.15±7.84 bc
                                                              姜黄素高剂量+CREB抑制剂组   11.26±0.63 d  124.68±7.63 d  144.48±7.52 d
          取总RNA，按照反转录试剂盒说明书方法将其反转录成
                                                                 a：与正常组相比，P＜0.05；b：与模型组相比，P＜0.05；c：与姜黄素
          cDNA，然后进行 PCR 扩增。本研究所用引物由北京擎
                                                              低剂量组相比，P＜0.05；d：与姜黄素高剂量组相比，P＜0.05。
          科生物技术有限公司设计、合成。β-肌动蛋白（β-actin）
                                                              3.2 姜黄素对模型大鼠血清中CORT和炎症因子水平
          正向引物为5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，反                 的影响
          向 引 物 为 5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′；                    与正常组相比，模型组大鼠血清中 CORT、TNF-α、
          CREB正向引物为5′-CCCCGATTTACCAAACTAG-3′，                 IL-1β、IL-6水平均显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，
          反向引物为 5′-TGCTTCAATGTTCTTCATT-3′；BDNF                阳性对照组和姜黄素低、高剂量组大鼠血清中上述指标
          正向引物为 5′-GACAAGGCAACTTGGCCTAC-3′，反                  水平均显著降低（P＜0.05）；且姜黄素高剂量组大鼠血
          向引物为 5′-CCTGTCACACACGCTCAGCTG-3′。反                  清中上述指标水平均显著低于姜黄素低剂量组（P＜
          应体系和反应条件均参照PCR试剂盒说明书设置，采用                           0.05）。与姜黄素高剂量组相比，姜黄素高剂量+CREB
          2 －ΔΔCt 法计算 CREB、BDNF mRNA 的表达水平，结果以                抑制剂组大鼠血清中上述指标水平均显著升高（P＜
          正常组为参照进行归一化处理。                                      0.05）。结果见表2。


          · 944 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 8                               中国药房  2024年第35卷第8期
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