Page 49 - 《中国药房》2024年7期
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脉过丝线后，松开动脉夹；将线栓沿颈总动脉、颈内动脉                          2.7 大鼠脑组织TLR4、NF-κB mRNA表达的检测
          前行，进入深度 18～19 mm，缝合皮肤，90 min 后拔线。                      采用实时荧光定量PCR法检测。取“2.5”项下各组
          若大鼠存活苏醒后行为和功能异常，同时 Zea Longa 评                     大鼠脑组织 100 mg，研磨后，加入 RNA 提取液 1 mL，充
          分为2～3分表示造模成功          [6―7] 。                      分研磨提取总 RNA。检测 RNA 浓度及纯度后，根据逆
              实验分为假手术组（仅分离血管不插线栓）、模型组                        转录试剂盒说明书 将 RNA 逆转录为 cDNA，再根据扩
         （造模不给药）、尼莫地平组（阳性对照，造模并给药）和                          增试剂盒说明书以 cDNA 为模板进行扩增。反应体系
          龙生蛭胶囊低、中、高剂量组（造模并给药），每组 10 只                       包括 2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，上、下游引物各
         （若造模过程中有大鼠死亡，则补足）。龙生蛭胶囊各组                           0.8 μL，cDNA 模板 1.6 μL，ddH2O 6.8 μL。反应条件为
          剂量根据临床常用剂量，按照成人等效剂量折算系数，                           95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火/延伸 30 s，
          以成人剂量的 6.25倍为龙生蛭胶囊中剂量，分别得到龙                        共 40 个循环。使用 Excel 软件，以 GAPDH 为内参，以
          生蛭胶囊低、中、高给药剂量分别为0.72、1.44、2.88 g/kg；               2 －ΔΔCt 法计算 TLR4、NF-κB mRNA 的相对表达水平。结
          尼莫地平组根据临床常用剂量同法换算，得尼莫地平给                           果以假手术组为参照进行归一化处理。上述实验重复3
          药剂量为20 mg/kg。于MACO术后第2天，各给药组大                      次。引物序列及产物长度见表1。
          鼠灌胃相应药液（以0.5%羧甲基纤维素钠溶液为溶剂，                                   表1 PCR引物序列及产物长度
          临用前配制），体积均为10 mL/kg；假手术组和模型组大                       基因名称        引物序列（5′→3′）                产物长度/bp
          鼠灌胃同体积生理盐水；每天1次，持续7 d。                              GAPDH       上游：CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG    138
                                                                          下游：GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT
          2.2 大鼠神经功能缺失情况评分                                    TLR4        上游：CCAGGTGTGAAATTGAGACAATTG  191
              于末次给药1 h后，采用Zea Longa 评分法对各组大                               下游：AAGCTGTCCAATATGGAAACCC
                                      [7]
          鼠的神经功能缺失情况进行评分 ，具体评分标准：无神                           NF-κB       上游：AACGCAAAAGGACCTACGAGA     156
          经损伤症状，记0分；悬尾实验不能完全伸展对侧前爪，                                       下游：TTGAAAAGGCATAGGGCTGG
          记1分；向对侧转圈，记2分；向对侧倾倒，记3分；无自主                        2.8 大鼠脑组织 TLR4、NLRP3、p-NF-κB 蛋白表达及
          活动或陷入深度昏迷中，记4分；死亡，记5分。                             细胞核内NF-κB蛋白表达的检测
          2.3 大鼠血清TNF-α、IL-6水平检测                                 采用Western blot法检测。取“2.5”项下各组大鼠脑
              采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测。神经功能缺                      组织 100 mg，提取总蛋白，在 4 ℃以 12 000 r/min 离心
          失评分结束后，各组大鼠腹腔注射麻醉，于腹主动脉取                           10 min进行组织裂解，取上清液于100 ℃下变性后保存，备
          血，以3 500 r/min离心20 min，收集上清液，按试剂盒说                 用；另取上述大鼠脑组织50 mg，按照核蛋白提取试剂盒
          明书方法检测血清TNF-α、IL-6水平。                              说明书提取核蛋白，于100 ℃下变性，测定蛋白浓度，进
          2.4 大鼠脑梗死体积检测                                      行8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转
              采用 TTC 染色观察。取“2.3”项下各组麻醉大鼠 5                   移蛋白至聚偏二氟乙烯膜上，室温封闭1 h；分别加入特
          只，行颈部脱臼处死后快速取脑，用预冷生理盐水冲洗，                          异性一抗（TLR4、NLRP3、p-NF-κB、NF-κB 的稀释度均
          并于－20 ℃下放置10 min，再将其置于专用脑槽内作厚                      为 1∶500；GAPDH、histone H3 的稀释度均为 1∶2 000），
          约 2 mm 的连续切片。将各切片放入 TTC 染液中，于避                     4 ℃孵育过夜；用TBST洗膜5次后，加入相应二抗（稀释
          光、37 ℃条件下孵育20 min，再于4%多聚甲醛中固定后                     度为 1∶2 000），室温孵育 1 h；用 TBST 洗膜 5 次后，用
          拍照。应用 Image J 软件扫描图片，观察大鼠脑梗死体                      ECL 化学发光试剂显色，再于化学发光成像仪下成像。
          积并计算脑梗死体积比[脑梗死体积比（%）＝（白色脑梗                         使用Gel-Pro Analyzer 4.0 软件分析，以TLR4、NLRP3蛋
          死体积/全脑总体积）×100%]。                                  白灰度值与内参GAPDH蛋白灰度值的比值表示大鼠脑
          2.5 大鼠脑组织病理形态观察                                    组织中TLR4、NLRP3蛋白的相对表达水平；以p-NF-κB
              采用 HE 染色观察。取“2.3”项下各组剩余麻醉大                     蛋白灰度值与 NF-κB 蛋白灰度值的比值表示大鼠脑组
          鼠 5 只，行颈部脱臼处死后快速取脑，将脑组织置入 4%                       织中NF-κB蛋白的磷酸化水平；以NF-κB蛋白灰度值与
          多聚甲醛中固定24 h，行常规石蜡包埋、切片（厚度4 μm），                    核内参histone H3蛋白灰度值的比值表示大鼠脑组织细
          备用。取切片，行常规HE染色，置于显微镜下观察大鼠                          胞核内NF-κB蛋白的相对表达水平。
          脑皮层的病理改变情况。                                        2.9 统计学方法
          2.6 大鼠脑组织NLRP3蛋白阳性表达的检测                                采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。计量资
              采用免疫组化法检测。取“2.5”项下各组大鼠的脑                       料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
          组织切片，经脱蜡及抗原修复后，滴加 NLRP3 一抗（稀                       进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          释度为1∶200），于37 ℃下孵育1 h；滴加相应二抗（稀释                    3 结果
          度为 1∶2 000），于 37 ℃下孵育 20 min，以 DAB 显色，再            3.1 龙生蛭胶囊对大鼠神经功能缺失的影响
          以苏木精复染，经分化、返蓝后封片，使用显微镜观察                               假手术组大鼠无神经功能损伤，神经功能缺失评分
          NLRP3蛋白阳性表达（呈棕黄色）情况。                               为0分。模型组、尼莫地平组和龙生蛭胶囊低、中、高剂


          中国药房  2024年第35卷第7期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 7    · 815 ·
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