Page 23 - 《中国药房》2024年7期
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基。培养 24 h 后，按照 Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡试剂盒             品，冷冻离心后收集上清液，浓度定量和蛋白变性。蛋
          说明书进行染色处理，再采用流式细胞仪检测细胞凋亡                           白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分
          率。流式细胞仪设四分门，其中Q1区域为坏死细胞，Q2                         离后，转移至聚偏二氟乙烯膜上，室温封闭 30 min。随
          区域为晚期凋亡细胞，Q3区域为活细胞，Q4区域为早期                         后，加入p-PI3K、p-Akt、VEGF-A、β-actin一抗（稀释比例
          凋亡细胞。细胞凋亡率（%）＝（Q2区域凋亡细胞+Q4区                        均为1∶1 000），4 ℃孵育，冷藏过夜；孵育后回收一抗，用
          域凋亡细胞）/细胞总数×100%。                                  TBST缓冲液洗膜5 min×5次，加入相应IgG二抗（稀释
          2.4 细胞增殖检测                                         比例为1∶3 000），室温下孵育120 min；以ECL发光液显
              采用克隆形成实验检测。按照“2.3”项下分组给药/                      色，并置于凝胶成像仪下成像。采用 Image J 软件进行
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          溶剂。取“2.1”项下对数生长期的细胞，按 1×10 个/                      分析，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值表示各蛋白
          mL、每孔2 mL接种至6孔板，待细胞过夜贴壁后移除培                        的相对表达水平。
          养基，每组换含有相应浓度药物/溶剂的培养基。含药培                          2.8 统计学方法
          养基每48 h更换1次，合计培养14 d。随后，收集各组细                          采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行数据处理和绘
          胞，以10%甲醇固定后，再以0.1%结晶紫染色；清洗后，                       图。计量资料满足正态分布以x±s表示，多组间比较采
          常温晾干。采用显微镜观察并统计各组细胞的有效克                            用方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。检验水
          隆数（＞10个细胞即为有效克隆），计算细胞克隆形成率                         准α＝0.05。
          [细胞克隆形成率（%）＝细胞有效克隆数/细胞总数×                          3 结果
          100%]。                                             3.1 CUR和ZER协同最佳浓度的确定结果
          2.5 细胞迁移能力检测                                           CCK-8 实验结果显示，CUR 剂量从 5 μmol/L 开始，
          2.5.1 划痕实验                                         对A549细胞的活力出现抑制作用，且CUR的抑制作用具
              按照“2.3”项下分组给药/溶剂。按照“2.1”项下制备                   有浓度依赖趋势。CUR抑制作用的IC50约为16 μmol/L，
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          浓度1×10 个/mL的细胞悬液，以每孔2 mL接种至6孔                      因此以 16 μmol/L 作为 CUR 的中浓度进行后续联合用
          板。使用记号笔在6孔板背面画作井字标记。在细胞贴                           药研究。ZER 剂量从 2.5 μmol/L 开始，对 A549 细胞的
          壁生长 80% 左右时，垂直于井字标记横线进行细胞划                         活力出现抑制作用，且ZER的抑制作用具有浓度依赖趋
          痕。移除培养基，每组换含有相应浓度药物/溶剂的培养                          势。ZER 抑制作用的 IC50 约为 12 μmol/L，因此以 12
          基。药物处理0、48 h，采用显微镜观察，取5个随机视野                       μmol/L作为ZER的中浓度进行后续联合用药研究。结
          进行拍照。采用 Image Pro Plus 6.0 软件获得细胞划痕                果见图1。
          距离并计算细胞迁移率[细胞迁移率（%）＝（0 h 划痕距                         125                      125
          离－48 h划痕距离）/0 h划痕距离×100%]。                           100        b             100      a  b
          2.5.2 Transwell迁移实验                                 细胞活力/%  75     b  b      细胞活力/%  75     b
              按照“2.3”项下分组给药/溶剂。取对数生长期细                          50                b      50             b  b
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          胞，采用空白培养基进行饥饿处理 6 h。随后，消化细                            0                        0
                                                                 0.625 1.25  2.5     5     10     20       40  0.625 1.25  2.5     5     10     20       40
          胞，并制备浓度1×10 个/mL的细胞悬液，以每孔0.2 mL                             浓度/（μmol/L）              浓度/（μmol/L）
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          接种至24孔板的Transwell小室（膜孔直径8 μm），每孔补                         A. CUR不同浓度组              B. ZER不同浓度组
          充含药培养基至 0.8 mL。24 h 后收集 Transwell 小室样                 a：与空白组比较，P＜0.05；b：与空白组比较，P＜0.01。
                                                             图1 不同浓度CUR、ZER单独对细胞活力的影响（x±s，
          品，拭去膜上残留细胞，随后采用10%甲醇固定，0.1%结
                                                                  n＝8）
          晶紫染色。样品清洗后，常温晾干，采用显微镜观察，在
          Transwell 小室下层，取 5 个随机视野进行拍照。采用                        根据CCK-8实验结果，选择CUR（8、16、32 μmol/L）
          Image Pro Plus 6.0软件统计迁移细胞数。                       和 ZER（6、12、24 μmol/L）的不同浓度组合研究抑制
          2.6 细胞侵袭能力检测                                       A549 细胞活力的协同效应。结果显示（表 1），CUR 8
              采用Transwell侵袭实验检测。按照“2.3”项下分组                  μmol/L+ZER 6 μmol/L、CUR 16 μmol/L+ZER 6 μmol/L、
          给药/溶剂。用 PBS 将基质胶 Matrigel 在冰上稀释配                   CUR 8 μmol/L+ZER 12 μmol/L、CUR 16 μmol/L+ZER 12
          制成适宜浓度，随后加入 Transwell 小室（膜孔直径 8                    μmol/L这些组合的CDI均在1.15以上，提示这些组合对
          μm），在 Transwell 小室培养箱放置 0.5 h 固化备用。后               A549 细胞的细胞活力的抑制均有协同作用。其中，
          续操作按照“2.5.2”项下实验进行，采用结晶紫法计算侵                       CUR 8 μmol/L+ZER 6 μmol/L 组合的 CDI 最大，其细胞
          袭细胞数。                                              增殖抑制率为（77.41±4.16）%，表明 CUR 8 μmol/L+
          2.7 细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的检测                       ZER 6 μmol/L 联用的协同作用最明显。因此，选择
              采用 Western blot 法检测。按照“2.3”项下分组给               CUR 8 μmol/L、ZER 6 μmol/L、CUR 8 μmol/L+ZER 6
          药/溶剂、进行细胞消化和接种。收集细胞，裂解制备样                          μmol/L进行后续实验研究。


          中国药房  2024年第35卷第7期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 7    · 789 ·
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