Page 22 - 《中国药房》2024年7期
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所突破，但临床治疗仍存在药物毒副作用大、患者多年                            Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡试剂盒、细胞周期试剂盒、Beyo
                             [1]
          生存率不理想等问题 ，因此迫切需要更加安全有效的                            ECL  Plus 显 色 试 剂 盒（货 号 分 别 为 C0043、C1062、
          肺癌治疗药物。                                             C1052、P0018M）均购自上海碧云天生物技术股份有限
              中药及其复方制剂具有毒性较低、副作用较少等优                          公司。
                                            [2]
          势，是肿瘤药物研发的新思路和新方向 。中药姜黄及                            1.3 细胞株
          姜黄属药用植物是目前国内外研究的热点之一。姜黄                                 人 NSCLC A549 细胞（批号 20211208）购自广州吉
          素（curcumin，CUR）是一种来源于姜黄的多酚类物质，                      妮欧生物科技有限公司。
                               [3]
          是姜黄的主要活性成分 。研究指出，CUR 具有抑制肿                          2 方法
          瘤、抗病毒、调节血脂等多种药理活性                [3―5] ，对结肠癌、肺      2.1 细胞培养与分组
          癌和乳腺癌等多种肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作                                 A549细胞冻存管解冻后用移液枪将细胞悬液转移
          用，并可诱导细胞凋亡和死亡             [5―6] 。花姜酮（zerumbone，     至 5 mL 离心管中，以 1 000 r/min 离心 5 min。吸弃上清
          ZER）是一种来源于姜科植物的单环倍半萜类物质，具                           液后，用1 mL完全培养基重悬细胞。向10 cm培养皿中
          有抗感染和调节免疫等多种药理活性，并能够抑制多种                            加入7 mL RPMI-1640完全培养基。将上述细胞悬液转
          肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移              [7―8] 。磷脂酰肌醇 3 激酶        移至培养皿中，混匀后，于37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养
         （phosphoinositide-3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein   箱恒温培养。待培养瓶中细胞长至80%时，用EDTA-胰
          kinase B，Akt）通路是细胞内重要的信号转导通路，可抑                     酶洗脱，再用 RPMI-1640完全培养基分别稀释细胞至实
          制多种刺激诱发的细胞凋亡、促进细胞周期进展，从而                            验需要的相应密度，即得细胞悬液。
          促进细胞的增殖或增强细胞对凋亡的抗性                  [9―10] 。本课题     2.2 CUR和ZER协同最佳浓度的确定
          组前期研究显示，CUR和ZER联用对人NSCLC A549细                      2.2.1 CCK-8实验
          胞存在协同效应倾向（拟另文发表）。本研究拟进一步                                取“2.1”项下对数生长期的细胞，按 8×10 个/mL、
                                                                                                      4
          探讨不同剂量 CUR 和 ZER 联用对 A549 细胞增殖、迁                    每孔 0.1 mL 接种至 96 孔板，待细胞过夜贴壁后移出培
          移、侵袭、凋亡等的协同作用，同时基于PI3K/Akt信号通                       养基，分别用不同浓度的CUR（0、0.625、1.25、2.5、5、10、
          路探讨潜在的作用机制，以期明确 CUR 和 ZER 联用对                       20、40  μmol/L）、ZER（0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40
          NSCLC 细胞的作用，为中药姜黄及其有效成分协同治                          μmol/L）、CUR+ZER[高、中、低浓度组合，分别以 CUR、
          疗NSCLC提供新思路和新方向。                                    ZER的半数抑制浓度（IC50 ）作为中浓度，低、高浓度分别
          1 材料                                                是中浓度的 1/2 和 2 倍]干预，并以 RPMI-1640 完全培养
          1.1 主要仪器                                            基为空白对照（空白组），每浓度设置8个复孔。培养24 h
              5427R型高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；                   后，每孔加入 CCK-8 试剂适量，孵育 2 h，使用酶标仪于
          DM2500型荧光倒置显微镜购自德国Leica公司；EVOS FL                   450 nm 波长处检测各孔的光密度（optical density，OD）
          型显微镜系统、3111 型 CO2培养箱均购自美国 Thermo                    值，并计算不同浓度组合的细胞增殖抑制率[细胞增殖
          Fisher Scientific 公司；Epoch 型酶标仪购自美国 BioTek          抑制率（%）＝（1－给药组OD值/空白组OD值）×100%]
          公司；Gel Doc EZ型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司；                   及药物IC50。以“1－细胞增殖抑制率”反映细胞活力。
          C6 plus型流式细胞仪购自美国BD公司。                              2.2.2 药物的联用效果分析
          1.2 主要药物与试剂                                             采用金氏公式计算药物的联用效果，CDI＝E （a+b） /
              CUR、ZER 标 准 品（批 号 分 别 为 wkq22010701、           （Ea+Eb－Ea×Eb ）。式中，CDI为增效指数，E （a+b） 为实测的
          wkq22020604，纯度均≥98%）均购自四川省维克奇生物                     两药联用效应，Ea为a药的单用效应，Eb为b药的单用效
          科技有限公司；DMEM培养基、RPMI-1640完全培养基、                      应；若 0.55＜CDI＜0.85，表明药物联用效应为拮抗；若
          乙二胺四乙酸（EDTA）-胰酶、青-链霉素双抗、基质胶                         0.85≤CDI＜1.15，表明药物联用效应为相加；若 1.15≤
          Matrigel（货号分别为 11965092、11875093、25200072、          CDI＜20，表明药物联用效应为协同             [11―12] 。根据 CDI，选
          15140148、20230948）均购自美国 Thermo Fisher Scien‐        择CUR和ZER联用后协同作用最明显的剂量进行后续
          tific 公司；胎牛血清（货号 10100147）购自美国 Gibco 公              实验。
          司；兔源磷酸化 PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）单           2.3 细胞凋亡检测
          克隆抗体、兔源 p-Akt 单克隆抗体、内参 β-肌动蛋白                           实验分为空白组（溶剂对照）、CUR组（CUR 8 μmol/L）、
         （β-actin）单克隆抗体（货号分别为 4228、4060、4967）均                ZER组（ZER 6 μmol/L）和CUR+ZER组（CUR 8 μmol/L+
          购自美国 CST 公司；兔源血管内皮生长因子 A（vascular                   ZER 6 μmol/L），剂量依据“2.2.1”和“2.2.2”结果设置，每
          endothelial growth factor A，VEGF-A）单克隆抗体、辣根         组设置 8 个复孔。取“2.1”项下对数生长期的细胞，按
                                                                   6
          过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗（货号分别为                           1×10 个/mL、每孔2 mL接种至6孔板，待细胞过夜贴壁
          46154、230806）均购自英国 Abcam 公司；CCK-8 试剂、               后移除培养基，各组换含有相应浓度药物/溶剂的培养


          · 788 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 7                               中国药房  2024年第35卷第7期
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