Page 21 - 《中国药房》2024年6期
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mA）诱颤，密切观察大鼠心电图及血压情况，及时调整                          件对血必净注射液活性成分与 GSNOR 蛋白（PDB 编号
          诱颤电流大小及导丝位置，直至大鼠出现室颤心律；诱                           3qj52）进行分子对接，评估结合能后使用 PyMOL 软件
          颤2.5～3 min后，关闭电源，大鼠呈自发室颤（自诱颤心                      对最优对接结构[结合能越低，结合活性越强；若结合
          电呈现室颤心电波形开始，持续室颤 6 min）。术中，所                       能≤－6 kcal/mol（1 kcal＝4.186 kJ）则表明分子间具有
                                                                           [14]
          有大鼠腹腔注射 3% 戊巴比妥 10 mg/（kg·h）行麻醉维                   较强的结合活性 ]进行可视化展示。
          持。室颤大鼠在心脏停搏5.5 min时，行呼吸机通气（吸                       2.5 动物实验验证
          入氧浓度为100%，通气频率为200次/min）；于心脏停搏                     2.5.1 分组、造模与给药
          6 min 时，予胸外按压（按压频率 200 次/min，按压深度 1                    取大鼠按“2.1”项下方法造模，将造模成功的大鼠分
          cm，按压部位为剑突上2.8 cm）进行复苏，以平均动脉压                      为模型组、抑制剂组、血必净组、血必净+抑制剂组，并设置
         （mean  arterial  pressure，MAP）≥60  mmHg（1  mmHg＝    假手术组，每组30只，雌雄各半。假手术组和模型组大
          0.133 kPa）持续5 min视为自主循环恢复[室颤大鼠于按                   鼠于术后通过颈外静脉注射与血必净组等体积的生理
          压心脏 5 min 后行电击除颤，如除颤后自主循环不能恢                       盐水；抑制剂组大鼠于术后通过颈外静脉注射 6 mg/kg
          复，需静脉注射肾上腺素（每次0.1 mg）；持续按压心脏20                     的 SPL-334.1（以生理盐水为溶剂，剂量参考相关文献                  [8]
          min，除颤3次，自主循环仍不能恢复者，视为复苏失败]。                       设置）；血必净组大鼠于术后通过颈外静脉注射4 mL/kg
                                                                                             [15]
          2.2 差异表达基因检测与验证                                    的血必净注射液（剂量参考相关文献 设置）；血必净+
              取大鼠按“2.1”项下方法造模，作为模型组；另取大                      抑制剂组大鼠于术后通过颈外静脉先后注射SPL-334.1
          鼠只分离右侧颈外静脉并置管而不进行CA/CPR 操作，                        和血必净注射液（剂量同各单药组）；每天2次，连续3 d。
          作为假手术组（下同）。取模型组和假手术组大鼠各5只                          2.5.2 取材
         （雄性3只、雌性2只），腹腔注射3%戊巴比妥（45 mg/kg）                        分别于药物首次干预后 3 h、24 h、3 d 时，从各组中
          麻醉后处死，提取其双侧海马组织（55～65 mg），研磨成                      选取大鼠 10 只，腹腔注射 3% 戊巴比妥（45 mg/kg）麻醉
          浆，使用 TRizol 液提取 RNA，检测纯度和浓度后，制备                    后处死；以仰卧位将四肢固定于解剖板上，开胸后充分
          RNA 文库；参考 Illumina DNA Prep 文库制备自动化工               暴露心脏，将灌注针头插入左心室，剪开右心耳，同时快
          作流程，以测序系统测序，剔除低质量的基因并筛除不                           速灌注生理盐水 100 mL；灌注完毕后于冰上断头取脑，
          表达的基因并作标准化处理后，运用 DRAGEN Germ‐                      用生理盐水冲去多余血液，在大脑中下 1/3 交界处完整
          line Pipeline软件对2组样本的测序数据进行分析，以假                   剥离双侧海马，迅速放入－80 ℃冰箱中保存，备检。
          手术组为对照，以|log2FC|≥1[FC 为表达量差异倍数                     2.5.3 大鼠神经功能评分及生存情况记录
         （fold change）]、P＜0.05 为标准 ，借助火山图筛选差异                    分别于“2.5.2”项下取材前对各组大鼠进行神经功
                                    [11]
          表达基因并确定 GSNOR 是否在其中，同时进行主成分                        能评分及生存情况记录。神经功能评分采用改良的神
          分析（principal component analysis，PCA）。随后，参照相        经系统损害严重程度评分表（modified neurologic severity
          应试剂盒说明书，采用ELISA法以酶标仪检测2组大鼠                         scale，mNSS）：该表总分为 18 分，其中 0 分为正常、1～6
          海马组织中的GSNOR、GSNO 含量，以验证差异表达基                       分为轻度损害、7～12分为中度损害、13～18分为重度损
                                                               [16]
          因的分析结果。                                            害 。大鼠生存情况采用 Cox 回归分析：使用 R 语言的
          2.3 血必净注射液活性成分筛选                                  “survival”包进行比例风险假设检验，同时进行生存回归
              在中药系统药理数据库与分析平台[Traditional                    拟合并绘制生存率曲线，使用“survminer”包和“ggplot2”
          Chinese  Medicine  Systems  Pharmacology  Database  and   包进行可视化展示。
          Analysis Platform（TCMSP），http：//tcmspw.com/tcmsp.  2.5.4 海马组织中GSNOR、GSNO含量检测
          php] 和 中 药 综 合 数 据 库 [Traditional  Chinese  Medicine     取“2.5.2”项下各时间点各组大鼠的双侧海马组织
          Integrated Database（TCMID），http：//119.3.41.228：8000/  适量，参照相应试剂盒说明书，采用 ELISA 法以酶标仪
          tcmid/]中搜索血必净注射液组方药材（红花、赤芍、川                       检测其中GSNOR、GSNO含量。
          芎、丹参、当归）所含成分，并运用TCMSP自带的“ADME                      2.5.5 GSNOR、GSNO含量与mNSS评分相关性评价
         （absorption，distribution，metabolism，excretion）”筛选功      运用 Pearson 法分析 GSNOR、GSNO 含量与大鼠
          能 ，以 血 脑 屏 障 透 过 率（blood-brain  barrier，BBB）≥         mNSS评分的相关性。
          －0.3、药物相似性评分（drug-likeness weight，DW）＞0.6          2.6 统计学方法
          为标准  [12―13] ，筛选度值（degree）排前10位的活性成分。                  采用 Excel软件录入数据，SPSS 19.0 软件进行统计
          2.4 血必净注射液活性成分与GSNOR的分子对接验证                        分析。符合正态分布且方差齐的计量资料以x±s表示，
              从 TCMSP、TCMID 数据库中获取各活性成分结构                    多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用SNK-q
          的“mol2”格式；运用 PDB 数据库（https：//www.rcsb.org）         检验；不符合正态分布或方差不齐的计量资料以中位数
          检索成分对应靶点的蛋白构象，使用 PyMOL 软件对蛋                        和四分位间距表示，组间比较采用 U 检验。检验水准
          白进行脱水处理后以“pdb”格式导出；利用AutoDock软                     α＝0.05。


          中国药房  2024年第35卷第6期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 6    · 655 ·
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