Page 78 - 《中国药房》2024年5期
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1.3 细胞                                              24 h 后弃掉培养液，5、15、30、60、120 min 组均加入含
              小鼠脑神经母瘤细胞 N2a 购自美国典型培养物保                        BC 4 μmol/L的分化培养液，对照组加入等体积溶剂，作
          藏中心。                                                用不同时间后收集各组细胞。弃掉细胞培养液，使用预
          2 方法                                                冷的 1×DPBS 清洗 1 次，每孔加入细胞裂解液、蛋白酶
          2.1 细胞培养                                            磷酸酶抑制剂混合物，收集细胞并在冰上裂解 30 min；
              将 N2a 细胞接种于含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-                  使用高速冷冻离心机离心（于 4 ℃预冷 15 min 后，以
          链霉素双抗的 MEM 培养基中，置于 37 ℃、5%CO2细胞                     12 000 r/min 离心 15 min），收集上清液，使用 BCA 蛋白
          培养箱中培养。待细胞融合至 60%～70% 时进行传代                         分析试剂盒检测总蛋白浓度，对上样蛋白进行定量（≥
         （每 3 d 传代 1 次），诱导分化液为含 0.5% 胎牛血清的                    20 μg/孔）；95 ℃煮蛋白10 min；使用聚丙烯酰胺凝胶电
          MEM培养基。                                             泳分离上样蛋白；将蛋白转移到 PVDF 膜，然后用含 5%
          2.2 细胞存活率的检测                                        的脱脂奶粉室温封闭 1 h；1×TBST 洗膜 3 次（每次 8
              采用 MTT 法检测。用含 0.5% 胎牛血清的 MEM 培                  min）后加入相应一抗（Akt、p-Akt、p-ERK1/2、p38、p-p38
          养基将 BC 母液（以细胞培养级 DMSO 原液为溶剂进行                       的稀释度均为1∶1 000，ERK1/2 的稀释度为 1∶2 000，β-
          溶解后制成10 mmol/L的母液）稀释成不同浓度（1、2、4、                    actin的稀释度为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；1×TBST洗膜
          6、8、10 μmol/L，浓度依据本课题组预实验结果确定）。                     3次，加入山羊抗兔/抗鼠IgG二抗（稀释度均为1∶1 000），
          取对数期生长的 N2a 细胞，用含 10% 胎牛血清的 MEM                     室温孵育1 h；1×TBST洗膜3次，ECL显影，采用自动曝
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          培养基制备细胞悬液，以5×10 个/孔的细胞密度接种于                         光分析系统对条带进行成像，分析实验结果。采用
          96 孔板中，每孔 100 μL。将实验分为 BC 不同浓度（1、                   Quantity One 软件统计各条带的灰度值，以各目的蛋白
          2、4、6、8、10 μmol/L）组、对照组（含细胞不含药物，加入                  与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示目的蛋白的
          给药组等量体积的溶剂）和空白组（不含细胞也不含药                            表达水平，以 p-Akt/Akt、p-ERK/ERK、p-p38/p38 比值表
          物），每组平行设置4个复孔。铺板24 h后，弃去上清液，                        示Akt、ERK、p38蛋白的磷酸化水平。
          加入相应药物/溶剂继续培养 48 h，然后每孔加入 10 μL                     2.5 抑制剂干预下 BC 激活信号通路关键蛋白磷酸化
          MTT试剂（5 mg/mL）（避光操作），放入37 ℃、5%CO2细                  及促神经分化的作用检测
          胞培养箱中孵育4 h；弃去上清液，每孔加100 μL DMSO                         采用 Western blot 法检测蛋白表达情况，细胞分化
          溶解，摇床 15 min 后使用酶标仪检测 490 nm 波长处各                   及神经突起长度检测方法同“2.3”项下。将细胞分为对
          孔的吸光度，计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝（BC                          照组、BC 组（最佳分化浓度 4 μmol/L）、LY 组、PD 组、
          组吸光度－空白组吸光度）/（对照组吸光度－空白组吸                           PD+BC 组、LY+BC 组（抑制剂 LY、PD 的浓度均为 10
          光度）×100%。                                           μmol/L，浓度依据本课题组预实验结果确定），每组平行
          2.3 细胞分化情况检测                                        设置3个复孔。同“2.4”项下方法处理细胞，换分化培养
              采用倒置显微镜拍照并测量。将对数生长期的N2a                         液1 h后，抑制剂组分别加入抑制剂LY/PD作用60 min，
          细胞常规消化后，以4×10 个/孔的细胞密度接种于6孔                         各组分别加入药物BC/等量溶剂进行处理（LY组药物作
                                 4
          板中，每孔2 mL。铺板24 h后，弃去培养液，换分化培养                       用 30 min，PD 组药物作用 60 min），检测细胞中 Akt、
          液。将实验分为对照组、RA组（10 μmol/L，浓度依据本                      ERK 蛋白的磷酸化水平。同法分组、给药和培养细胞，
          课题组预实验结果确定）和 BC 不同浓度组（1、2、4                         加入抑制剂 PD/LY 作用 60 min 后，各组再加 BC/等量溶
          μmol/L，浓度依据MTT实验筛选所得），每组平行设置3                       剂，作用 48 h 后检测抑制剂 PD/LY 对 BC 诱导的 N2a 细
          个复孔。分别继续培养 48、72 h 后使用倒置显微镜观                        胞分化的影响，对分化细胞的神经突起长度进行测量并
          察、拍照，并用 Image J 软件进行图像处理，对图片中的                      计算细胞分化率。
          分化细胞进行数量统计，检测BC对N2a细胞分化的影响。                         2.6 统计学方法
          分化细胞指神经突起长度大于 2 倍胞体直径的细胞 。                              采用 GraphPad Prism 8.0 软件对实验数据进行统计
                                                       [12]
          对分化细胞的神经突起长度进行测量并计算细胞分化                             分析。实验数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差
          率，细胞分化率（%）＝分化细胞数/细胞总数×100%。                         分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          2.4 细胞中Akt、ERK和p38蛋白磷酸化水平检测                         3 结果
              采用 Western blot 法检测。根据作用时间的不同，                  3.1 BC对N2a细胞存活率的影响
          分为作用0（对照）、5、15、30、60、120 min组，每组平行设                     与对照组比较，BC 1、2、4、6 μmol/L 组细胞的存活
                                                     5
          置4个培养皿。将对数生长期的N2a细胞按3×10 个/皿                        率差异均无统计学意义（P＞0.05），而 BC 8、10 μmol/L
          的密度均匀铺至6个60 mm培养皿中，每皿4 mL。培养                        组细胞的存活率显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。其中，


          · 580 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 5                               中国药房  2024年第35卷第5期
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