Page 51 - 《中国药房》2024年5期

份有限公司，动物生产许可证号为 SCXK（辽）2020- 5% 脱脂奶粉在 37 ℃下封闭 90 min；加入 p38 MAPK、
0001。大鼠购入后，饲养于SPF级实验室。大鼠先在适 p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、MCP-1、TNF-α、
宜温度和湿度条件下适应性饲养1周，期间自由摄取食 IL-6、GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃孵育过
物和水。本实验经佳木斯大学生物与医学伦理委员会 夜；TBST 洗膜 4 次、每次 5 min，加入二抗，先室温摇床
批准，批准编号为JMSU-2022061001。 30 min，再在 37 ℃下孵育 1 h；TBST 洗膜 4 次、每次 5
2 方法 min，ECL 显影、曝光，采用光密度扫描仪计算条带积分
2.1 PAP的制备及结构特征考察 光密度。以各目标蛋白与内参蛋白（GAPDH）条带积分
取干燥关黄柏药材饮片，用90%乙醇回流3次除去 光密度的比值表示目标蛋白的表达水平 ，以 p-p38
脂肪油和色素；药渣阴干后加15倍量（kg/L）水回流提取 MAPK和p38 MAPK、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表
3 次，每次 2 h。提取液浓缩后加入 98% 乙醇得到粗制 达的比值分别表示 p38 MAPK、NF-κB p65 蛋白的磷酸
PAP，提取率为 4.41%。采用木瓜蛋白酶对粗制 PAP 进 化水平。
行脱蛋白处理，并用大孔吸附树脂AB-8脱色后，得精制 2.3 统计学方法
PAP。通过红外光谱、紫外光谱、扫描电镜探究PAP结构 使用GraphPad 8.0软件进行统计学分析。数据采用
特征；用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化后，采 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
用高效液相色谱法测定其单糖组成及比例 [7―8] 。 比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
2.2 PAP抗GN作用考察 3 结果
2.2.1 分组、造模与给药 3.1 PAP的制备与结构特征测定结果
大鼠适应性喂养 1 周后，将其按体重分层后随机分 红外光谱分析结果表明，PAP 含有糖类特征吸收
为 6 组，即正常组（Con 组）、模型组（Mod 组）、AP 组和 峰，可确定为多糖类化合物。紫外光谱分析结果显示，
PAP 高、中、低剂量组（PAP-H、PAP-M、PAP-L 组），每组 在紫外可见光谱范围内无吸收峰，表明纯化后的PAP不
10 只。除 Con 组外，其余各组大鼠均采取 1 500 mg/kg 含有蛋白质和核酸。扫描电镜观察结果显示，PAP呈块
氧嗪酸钾和 100 mg/kg 腺嘌呤联合灌胃 14 d 构建大鼠 状，表面粗糙，结构排列松散，部分带有孔洞。对比混合
[9]
GN模型 。经检测，所有大鼠均造模成功，表现为尿酸、 单糖标准品的保留时间，并根据峰面积计算，可知 PAP
[10]
尿蛋白含量均显著升高 。造模成功后，PAP-H、PAP- 由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半
M、PAP-L 组大鼠分别灌胃 100、50、25 mg/kg PAP（以生 乳糖及木糖共 7 种单糖组成，7 种单糖组成的摩尔比为
药量计，分别为成人临床用量的 2、1、0.5 倍等效剂量）； 2.00∶12.09∶1.00∶1.63∶2.99∶10.55∶10.44。结果见图1。
AP组大鼠灌胃20 mg/kg AP（成人临床等效剂量）；Con组 0.8
60 0.7
和Mod组大鼠灌胃等体积水；每日给药1次，连续28 d。
50 0.6
2.2.2 大鼠血清中肾功能相关生化指标含量检测 透光率/% 40 2 813 1 380 1 101 吸光度 0.5
0.4
末次给药 24 h 后，于大鼠眼部取血，然后以 4 500 30 1 350 0.3
20 0.2
r/min 离心 15 min，取上层血清，按试剂盒说明书操作检 10 3 423 1 593 0.1 0
测血清中尿酸、Cr、BUN、XOD含量。 4 000 3 000 2 000 1 000 200 220 240 260 280 300 320 340
波数/cm －1 波长/nm
2.2.3 大鼠肾组织病理形态学观察 A. PAP红外光谱图 B. PAP紫外光谱图
取血后将大鼠处死，取出肾脏。取部分大鼠肾脏， 180 混合单糖标准品
160 PAP
用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗后 140 2
120 6
于 10% 多聚甲醛溶液中固定，然后制备石蜡切片（厚度 mAU 100 1 3 5 7
80
4 μm），进行常规HE染色后，用显微镜观察大鼠肾组织 60 1 4
40 2 6 7
病理形态学变化。 20 0 3 4 5 8 9
2.2.4 大鼠肾组织中 p38 MAPK/NF-κB/TNF-α 信号通 0 20 40 60 80 100 120
t/min
路相关蛋白表达检测 C. PAP扫描电镜图 D. PAP单糖组成分析的色谱图
采用 Western blot 法进行检测。取部分大鼠肾组 1：甘露糖；2：鼠李糖：3：葡萄糖醛酸；4：半乳糖醛酸；5：葡萄糖；
6：半乳糖；7：木糖；8：阿拉伯糖；9：岩藻糖。
织，用 PBS 洗涤后，加入蛋白裂解液充分研磨并超声破
图1 关黄柏多糖的结构表征鉴定情况
碎，冰浴 30 min，然后在 4 ℃下以 14 000 r/min 离心 15
min，取上清液，加入上样缓冲液混匀，煮沸 10 min。按 3.2 PAP对大鼠血清中肾功能相关生化指标的影响
照一定比例配制电泳溶液、制胶，待浓缩胶凝固后将胶 与 Con 组比较，Mod 组大鼠血清中尿酸、Cr、BUN、
板固定于电泳槽中，上样孔中加入 5 μL 蛋白样品，在 XOD 含量均显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）；与 Mod 组
100 V 电压下电泳 40 min，然后湿法转至 PVDF 膜，加入 比较，AP 组和 PAP-H、PAP-M 组大鼠血清中尿酸、Cr、

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