Page 54 - 《中国药房》2024年4期
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长处检测各孔的OD值，用以反映细胞增殖情况。                              剂量参考预实验结果及相关文献               [8，13] 设定，具体处理过
             （2）EdU 染色实验：取对数生长期的 A549 细胞，以                    程如下：裸鼠-胡黄连苷Ⅱ低、中、高剂量组裸鼠分别腹
          1×10 个/孔接种于 96 孔板中，按照“2.1.2”项下方法分                   腔注射25、50、100 mg/kg的胡黄连苷Ⅱ；裸鼠-K6PC-5组
               4
          组（每组设 6 个复孔）、处理。随后，于每孔中加入 50                        裸鼠腹腔注射 0.007 5 mg/kg 的 K6PC-5；裸鼠-胡黄连苷
          μmol/L的EdU染液适量，染色2 h；弃去染液，细胞以4%                     Ⅱ高剂量+K6PC-5组裸鼠同时腹腔注射100 mg/kg的胡
          多聚甲醛固定 1 h 后，以阿波罗染液染色 30 min，再以                     黄连苷Ⅱ和 0.007 5 mg/kg 的 K6PC-5；裸鼠-对照组裸鼠
          4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液染核20 min。使用                  腹腔注射生理盐水。各组裸鼠均每天注射1次，持续30
          荧光显微镜观察，使用Image J软件对EdU阳性细胞（呈                       d。30 d 后，处死裸鼠，分离并收集其瘤体，称定瘤体质
          绿色荧光）进行计数并按下式计算 EdU 阳性细胞率：                          量并按下式计算瘤体体积：肿瘤体积＝0.5×a×b（式
                                                                                                         2
          EdU阳性细胞率＝EdU阳性细胞数/总细胞数×100%。                        中，a为瘤体长径，b为瘤体短径）。
          2.1.4 细胞迁移能力检测                                      2.3 统计学方法
              采用划痕实验检测。取对数生长期的 A549 细胞，                           采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。实验数
                 5
          以 2×10 个/孔接种于 24 孔板中，培养，待细胞铺满后，
                                                              据以 x±s 表示，多组间差异分析采用单因素方差分析，
          用无菌移液器枪头在板内垂直划线，用磷酸盐缓冲液清                            进一步两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          洗后，将细胞按照“2.1.2”项下方法分组（每组设 6 个复                      3 结果
          孔）、处理。使用光学显微镜分别于处理 0、24 h 时观察                       3.1 细胞实验结果
          并测量各组细胞的划痕宽度，并按下式计算划痕愈合
                                                              3.1.1 胡黄连苷Ⅱ干预浓度的筛选结果
          率：划痕愈合率＝（0 h 时的划痕宽度－24 h 时的划痕宽
                                                                  随着胡黄连苷Ⅱ浓度的升高，细胞存活率显著降低
          度）/0 h时的划痕宽度×100%。
                                                             （P＜0.05），且有一定的浓度依赖趋势：在0、1.25、2.5、5、
          2.1.5 细胞侵袭能力检测
              采用Transwell实验检测。取对数生长期的A549细                    10、20、40、80 μmol/L胡黄连苷Ⅱ作用下，细胞存活率依
          胞，用不含血清的RPMI 1640培养基重悬至1×10 个/mL，                   次 为 （99.97±0.03）% 、（97.78±0.12）% 、（89.95±
                                                   6
          取上述细胞悬液 100 μL 置于 Transwell 上室，同时将                  0.23）% 、（80.55±0.36）% 、（73.36±0.28）% 、（65.57±
                                                              0.23）%、（54.43±0.26）%、（43.94±0.22）%。因此，本研
          含 10% 胎 牛 血 清 的 RPMI  1640 培 养 基 500  μL 置 于
          Transwell下室，培养24 h。将上层细胞按照“2.1.2”项下                 究选择胡黄连苷Ⅱ 40 μmol/L 作为后续干预的高浓度，
          方法分组（每组设6个复孔）、处理。随后，去除上室底部                          以10、20 μmol/L作为后续干预的低、中浓度。
          未穿膜的细胞，将侵袭细胞（即穿膜细胞）用 4% 多聚甲                         3.1.2 胡黄连苷Ⅱ对A549细胞增殖的影响
          醛固定，再以0.1%结晶紫染液染色，使用光学显微镜观                              与对照组比较，胡黄连苷Ⅱ各浓度组的细胞 OD450
          察细胞侵袭情况并记录侵袭细胞数。                                    值、EdU 阳性细胞率均显著降低，且呈浓度依赖性（P＜
          2.1.6 细胞中 PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白及 SPHK1/               0.05）；而 K6PC-5 组的细胞 OD450值、EdU 阳性细胞率均
          S1P/S1PR3信号通路相关蛋白表达检测                               显著升高（P＜0.05）。与胡黄连苷Ⅱ高浓度组比较，胡
              采用Western blot法检测。取对数生长期的A549细                  黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组的细胞OD450值、EdU阳性细
          胞，以2×10 个/孔接种于24孔板中，按照“2.1.2”项下方                    胞率均显著升高（P＜0.05）。结果见表1、图1。
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          法分组（每组设6个复孔）、处理。随后，收集各组细胞，                          表1 各组 A549 细胞 OD450 值、EdU 阳性细胞率比较
          裂解并提取其总蛋白。对蛋白进行定量、变性、电泳分                                （x±s，n＝6）
          离、转膜、封闭后，加入PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、                  组别                    OD 450值       EdU阳性细胞率/%
          S1PR3、ERK1/2、GAPDH一抗（稀释比例分别为1∶4 000、                对照组                  0.92±0.06       58.86±2.37
          1∶4 000、1∶3 000、1∶3 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000），   胡黄连苷Ⅱ低浓度组            0.83±0.07 a     50.69±2.15 a
                                                              胡黄连苷Ⅱ中浓度组            0.71±0.06 ab    43.37±2.06 ab
          于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为
                                                              胡黄连苷Ⅱ高浓度组            0.44±0.03 abc   28.85±1.33 abc
          1∶2 000），于室温下孵育1.5 h；洗膜后，以电化学发光试                    K6PC-5组              1.21±0.11 a     66.72±2.85 a
          剂显影，再置于凝胶成像系统下成像。使用 Image J 软                       胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组     0.75±0.06 d     46.65±2.17 d
          件 分 析 各 蛋 白 的 灰 度 值 ，以 目 的 蛋 白 与 内 参 蛋 白               a：与对照组比较，P＜0.05；b：与胡黄连苷Ⅱ低浓度组比较，P＜
         （GAPDH）的灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。                           0.05；c：与胡黄连苷Ⅱ中浓度组比较，P＜0.05；d：与胡黄连苷Ⅱ高浓度
          2.2 移植瘤裸鼠实验                                         组比较，P＜0.05。
              取1×10 个/mL的A549细胞悬液0.2 mL，皮下接种                  3.1.3 胡黄连苷Ⅱ对A549细胞迁移的影响
                     7
          于 BALB/c 裸鼠腋窝，建立 NSCLC 移植瘤裸鼠模型（接                        与对照组比较，胡黄连苷Ⅱ各浓度组细胞的划痕愈
          种后第 7 天，若移植瘤长径＞5 mm，则判定造模成                          合率均显著降低，且呈浓度依赖性（P＜0.05）；而K6PC-5
            [12]
          功 ）。取造模成功的裸鼠 30 只，随机分为裸鼠-对照                         组细胞的划痕愈合率显著升高（P＜0.05）。与胡黄连苷
          组，裸鼠-胡黄连苷Ⅱ低、中、高剂量组，裸鼠-K6PC-5组，                      Ⅱ高浓度组比较，胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组细胞的
          裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量+K6PC-5组，每组5只。各药物                        划痕愈合率显著升高（P＜0.05）。结果见表2、图2。


          · 432 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 4                               中国药房  2024年第35卷第4期
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