Page 53 - 《中国药房》2024年4期
P. 53

concentration+K6PC-5  group  cells  and  the  nude  mouse-picroside  Ⅱ  high-dose+K6PC-5  group  nude  mice  were  significantly
          increased  or  enlarged （P＜0.05）.  CONCLUSIONS  Picroside  Ⅱ  may  inhibit  the  malignant  progression  of  NSCLC  by  inhibiting
          SPHK1/sphingosine-1-phosphate/S1PR3 signaling pathway.
          KEYWORDS    picroside  Ⅱ；  non-small  cell  lung  cancer；  proliferation；  migration；  invasion；  sphingosine  kinase  1/sphingosine-1-
          phosphate/sphingosine-1-phosphate receptor 3 signaling pathway


              非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）       1/2，ERK1/2）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗
          是肺癌最普遍的组织学亚型，占所有肺癌病例的85%～                          体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔 IgG 二抗（批
          90% 。目前，NSCLC的治疗主要以西医手段为主，包括                       号分别为ab92552、ab92536、ab76003、ab302714、ab248131、
             [1]
                                             [2]
          手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等 。然而，这些                         ab184699、ab128915、ab6721）均购自英国 Abcam 公司；
          治疗通常伴有复发、转移、患者预后差等不良结局，且治                          RPMI 1640培养基（批号R10-041）购自北京毕特博生物
                      [3]
          疗成本较高等 。此外，诸多靶向药物虽可延长晚期                            技术有限责任公司；电化学发光试剂（批号20221226）购
          NSCLC 患者的生存期，但耐药性会严重影响其长期                          自北京三品医疗科技有限公司。
              [4]
          疗效 。                                               1.3 实验动物与细胞
              研究表明，中医药对 NSCLC 的辅助治疗或患者预                          SPF 级雄性 BALB/c 裸鼠 30 只，5～6 周龄，体重
          后有促进作用，可减少不良反应的发生，并具有良好的                           18.5～19.5 g，购自山东艾莱克生物科技有限公司，动物
                [5]
          耐受性 。胡黄连苷Ⅱ是中药胡黄连提取物的主要活性                           生产许可证号为 SCXK（鲁）2022 0007。本研究方案获
                                                [6]
          成分之一，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等作用 。已有研                          得长春中医药大学实验动物伦理委员会批准，批准编号
          究报道，胡黄连苷Ⅱ可抑制人肾癌ACHN细胞的增殖并                          为2021309。
                    [7]
          促进其凋亡 ，还可抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的                         人 NSCLC 细胞系 A549 购自中国科学院上海生科
                    [8]
          迁移和侵袭 。这提示胡黄连苷Ⅱ具有一定的抗肿瘤活                           院细胞资源中心。
          性，但其能否抑制 NSCLC 的恶性进展尚不明确。相关                        2 方法
          研 究 显 示 ，抑 制 鞘 氨 醇 激 酶 1（sphingosine  kinase  1，   2.1 细胞实验
          SPHK1）/1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）/       2.1.1 细胞培养及胡黄连苷Ⅱ干预浓度的筛选
          1-磷酸鞘氨醇受体3（sphingosine-1-phosphate receptor 3，         取 A549 细胞，于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培
          S1PR3）信号通路可抑制乳腺癌干细胞的增殖 ，以及肺                        养基中培养。取对数生长期的A549细胞，以1×10 个/孔
                                                 [9]
                                                                                                        4
                                    [10]
          淋巴管肌瘤细胞的增殖与侵袭 。这提示 SPHK1/S1P/                      接种于 96 孔板中，分别用 0（对照组）、1.25、2.5、5、10、
          S1PR3信号通路参与了肿瘤的进展，但胡黄连苷Ⅱ能否                         20、40、80 μmol/L 的胡黄连苷Ⅱ处理 24 h，并设置不含
          通过调节SPHK1/S1P/S1PR3信号通路来抑制NSCLC的                   细胞、不含药物的空白组（每个浓度设置 6 个复孔）；随
          恶性进展尚不清楚。基于此，本研究拟基于上述信号通                           后，于每孔中加入 CCK-8 试剂 10 μL，于 37 ℃下孵育 2
          路探究胡黄连苷Ⅱ对NSCLC恶性进展的影响及潜在机                          h，使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）
          制，以期为NSCLC的治疗药物提供更多选择。                             值，计算细胞存活率[细胞存活率＝（实验组 OD 值－空
          1 材料                                               白组 OD 值）/（对照组 OD 值－空白组 OD 值）×100%]，
          1.1 主要仪器                                           并将细胞存活率接近 50% 时对应的胡黄连苷Ⅱ浓度作
              xMark 型酶标仪、165-8001 型蛋白电泳仪、Bio-Rad             为胡黄连苷Ⅱ干预的高浓度用于后续实验。
          GelDoc XR+凝胶成像系统均购自美国 Bio-Rad 公司；                  2.1.2 细胞分组与处理
          DM2500 型荧光显微镜购自德国 Leica 公司；E100 型光                     取对数生长期的A549细胞，随机分为对照组，胡黄
          学显微镜购自日本Nikon公司；SCO2W-2型细胞培养箱                      连苷Ⅱ低、中、高浓度组，K6PC-5 组，胡黄连苷Ⅱ高浓
          购自美国SHELLAB公司。                                     度+K6PC-5 组。各药物浓度参考“2.1.1”项下结果及相
          1.2 主要药品与试剂                                        关文献   [8，11] 设定，具体处理过程如下：胡黄连苷Ⅱ低、中、
              胡黄连苷Ⅱ对照品（批号 39012-20-9，纯度≥98%）                 高浓度组细胞分别用10、20、40 μmol/L的胡黄连苷Ⅱ处
          购 自 上 海 陌 孚 医 药 科 技 有 限 公 司 ；K6PC-5 对 照 品          理 24 h；K6PC-5 组细胞用 10 μmol/L 的 K6PC-5 处理 24
         （SPHK1 激活剂，批号 SML1709，纯度≥98%）购自北京                   h；胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组细胞用40 μmol/L的胡
          百奥创新科技有限公司；CCK-8试剂盒（批号20220703）                    黄连苷Ⅱ和10 μmol/L的K6PC-5共同处理24 h；对照组
          购自北京沃比森科技有限公司；5-乙炔基-2′-脱氧尿苷                        细胞正常培养24 h。
         （EdU）染色试剂盒（批号 CA1170）购自北京索莱宝科技                      2.1.3 细胞增殖检测
          有 限 公 司 ；兔 源 增 殖 细 胞 核 抗 原（proliferating  cell        （1）CCK-8实验：取对数生长期的A549细胞，以2×
                                                               3
          nuclear antigen，PCNA）、基质金属蛋白酶 2（matrix me‐         10 个/孔接种于 96 孔板上，按照“2.1.2”项下方法分组
          talloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、SPHK1、S1PR3、胞      （每组设 6 个复孔）、处理。随后，于每孔中加入 CCK-8
          外信号调节激酶 1/2（extracellular signal-regulated kinase   试剂10 μL，于37 ℃下孵育2 h，使用酶标仪在450 nm波


          中国药房  2024年第35卷第4期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 4    · 431 ·
   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58