Page 56 - 《中国药房》2024年3期
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1.3 实验动物                                            量＝（粪便干燥前质量－粪便干燥后质量）/粪便干燥前
              本研究所用动物为 SD 大鼠，6 周龄，体重为（200±                    质量×100%。
          20） g，雌雄各半，购自成都达硕实验动物有限公司，动物                        2.4 大鼠肠道敏感性的检测
          生产许可证号为SCXK（川）2020-030。大鼠饲养环境温                          末次给药后，参考文献[13]的方法对大鼠进行腹壁
          度为（25±2） ℃，相对湿度为50%～60%，自由饮食。本                      撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）阈值测量，

          实验经贵州中医药大学动物伦理委员会审批通过（批准                            即记录各组大鼠出现腹部抬起和背部弓起反应的最小
          号为 20220104），动物使用许可证号为 SYXK（黔）2021-                 注水量（mL），每只大鼠测量 3 次取平均值，时间间隔为
          0005。                                               30 s。AWR阈值越高，表明其肠道敏感性越低。
          2 方法                                                2.5 大鼠肠道推进率的检测
          2.1 药液的制备                                               末次给药后，大鼠禁食不禁水18 h，腹腔注射4%戊
          2.1.1 番泻叶水煎液                                        巴比妥钠进行麻醉，经腹主动脉采集血清样品后，取3只
              称取番泻叶 300 g，加水 1 500 mL，浸泡 2 h，武火煮              大鼠灌胃 0.5 mL 含 5% 黑色活性炭的半固体混悬液；30
          沸，文火煎煮 10 min；过滤，浓缩，即得质量浓度为 1                       min 后处死，立即打开腹腔，分离肠系膜，截取从幽门至
          g/mL的番泻叶水煎液（以生药量计）。                                 结肠末端的整段大小肠，直线平铺于白纸上，然后用直
          2.1.2 白术-木香药对水煎液                                    尺测量幽门至黑色活性炭前沿的距离以及至结肠末端
              根据香砂六君子汤原方中白术和木香的比例，称取                          的距离，并计算肠道推进率。肠道推进率＝幽门至黑色
          白术 12 g、木香 4 g，先加入 8 倍量纯化水（mL/g，下同），                活性炭前沿的距离/幽门至结肠末端的距离×100%。肠

          以武火煮开后再以文火煎30 min，过滤，收集滤液；加入                        道推进率检测结束后，收集各大鼠结肠组织、粪便样品，
          6倍量纯化水以武火煮开后再以文火煎煮20 min，过滤，                        并将剩余3只大鼠处死，同法收集上述样品。
          收集滤液；合并 2 次滤液，在 100 ℃水浴条件下进行浓                       2.6 大鼠血清中5-HT、SP水平的检测
          缩，即得质量浓度为 1.4 g/mL 的白术-木香药对水煎液                          取各组大鼠血清样品，按ELISA试剂盒说明书方法
         （以生药量计）。                                             操作，检测大鼠血清中5-HT、SP水平。
          2.2 分组、造模及给药                                        2.7 大鼠结肠组织的病理学形态观察
                                       [11]
              参考相关文献方法进行造模 ：给 40 只 SD 大鼠灌                         取 3 只大鼠结肠组织置于 4% 多聚甲醛中固定，制
          胃番泻叶水煎液，给药体积为10 mL/kg，每日2次，连续                       作石蜡切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水合、苏木精-伊
          14 d。大鼠每次灌胃番泻叶水煎液后，采取弹力绷带束                          红染色、梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，使用中性树胶封
          缚其两前肢和肩背部，限制其上半身活动，持续 2 h；束                         固，然后采用光学显微镜观察大鼠结肠组织的病理
          缚期间联合给予夹尾刺激（用止血钳夹大鼠尾部，刺激                            变化。
          其产生抓咬、怒叫、站立弓背等反应），每次夹尾 3～5                          2.8 大鼠结肠组织中 5-HT3R、5-HT4R、SERT 蛋白表
          min。14 d后观察大鼠，当其出现食少纳呆、泄泻严重甚                        达水平的检测
          至脱肛等主要症状，以及消瘦、体重减轻、神态萎靡、四                               采用 Western blot 法检测。取各组大鼠结肠组织适
          肢不收、毛色枯槁、蜷缩聚堆、易疲劳中的2项次要症状                           量进行总蛋白提取，使用 BCA 试剂盒定量组织中的蛋
          时，表明脾虚IBS-D造模成功。                                    白浓度后，变性失活，在凝胶电泳下分离，转膜；使用5%
              取 30 只造模成功的大鼠，分为模型组和白术-木香                       脱脂牛奶室温封闭 2 h，加入 5-HT3R、5-HT4R、SERT、
          药对低、中、高剂量组（0.7、1.4、2.8 g/kg，中剂量根据成人                 β-actin一抗（稀释度均为1∶1 000）置于4 ℃下孵育过夜，

          和大鼠的体表面积换算而得）以及阳性对照组（匹维溴                            然后加入相应二抗室温孵育 2 h；以 TBST 洗涤 3 次，采
          铵1.5 mg/kg，剂量参考文献[12]设置），每组6只；另取6只                  用 ECL 系统对蛋白条带进行显色，以目的蛋白与内参
          健康大鼠作为空白对照组。空白对照组与模型组大鼠灌胃                           β-actin的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
          生理盐水，其余各组灌胃相应药液，每天1次，连续14 d。                        2.9 大鼠粪便的16S rRNA测序
          2.3 大鼠一般状况观察及粪便含水量检测                                    取空白对照组、模型组和白术-木香药对高剂量组
              记录各组大鼠给药后1、7、14 d的体重，并观察其腹                      大鼠的粪便样本各适量，使用试剂盒对样本进行 DNA
          泻程度、精神状态及进食状况。收集大鼠粪便样本，经                            提取与定量，扩增 16S rRNA 基因 V3-V4 区域，纯化回
          恒温加热干燥至恒重后，计算粪便含水量。粪便含水                             收，采用 Illumina 公司的 TruSeq Nano DNA LT Library


          · 306 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 3                               中国药房  2024年第35卷第3期
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