Page 29 - 《中国药房》2024年3期
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2.2 蓝盆花醇提物含药血清的制备                                  环。以β-actin为内参，采用2       －△△Ct 法分析目的基因mRNA
              将 28 只 Wistar 大鼠随机分为空白组与含药血清制                  表达水平。实验重复3次。PCR引物序列由生工生物工
          备组，每组14只。含药血清制备组大鼠按1 800 mg/（kg·d）                 程（上海）股份有限公司设计并合成，详细信息见表1。
         （以生药量计）灌胃蓝盆花醇提物（蓝盆花的成人临床用                                   表1 PCR引物序列及扩增产物长度
          量为 2～3 g，在制备含药血清时按成人用量 2.4 g 换算，                    基因名称         引物序列（5′→3′）              扩增产物长度/bp
          本实验剂量相当于8倍成人临床等效剂量），空白组大鼠                           PI3K         上游：GCTGTTGATAGACCACCGCTTCC  24
                                                                           下游：TGCCCTGTTCCTCTGCCTTCC
          灌胃等体积生理盐水，每天给药1次，持续1周。末次给
                                                              Akt          上游：CAAGCACCGTGTGACCATGA     20
          药/生理盐水 2 h 后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，静置 20                                   下游：TCAGTAAGCGTGTGGGCAAC
          min，然后在 4 ℃离心机中以 3 000 r/min 离心 15 min，收            PTEN         上游：TTGAAGACCATAACCCACCACAGC  24
                                                                           下游：CATTACACCAGTCCGTCCTTTCCC
          集上层血清，用0.22 μm滤膜过滤，即得空白血清和含药
                                                              Collagen Ⅰ   上游：TGTTGGTCCTGCTGGCAAGAATG  23
          血清，－80 ℃冰箱中保存备用。                                                 下游：GTCACCTTGTTCGCCTGTCTCAC
          2.3 体内动物实验                                          α-SMA        上游：CATCCACGAAACCACCTA       18
                                                                           下游：GGGCAGGAATGATTTGGA
          2.3.1 动物造模及分组
                                                              β-actin      上游：ACCCGCGAGTACAACCTTCT     20
              将剩余的50只大鼠按随机数字表法分成5组，即空                                      下游：TTCAGGGTCAGGATGCCTCT
          白组、模型组和蓝盆花醇提物低、中、高剂量组（50、100、
                                                             2.3.5 大鼠肝组织中HF指标及PI3K/Akt信号通路相关
          200 mg/kg，以生药量计；按成人用量 2.0 g 换算，分别为
                                                             蛋白表达的检测
          成人临床等效剂量的0.5、1、2倍），每组10只。除空白组
                                                                 采用 Western blot 法进行检测。取“2.3.2”项下冻存
          外，其余各组大鼠均参考文献[10]采用 CCl4灌胃法进行
                                                             的肝组织，加入 RIPA 裂解液提取组织中总蛋白，加入
          造模：每周二和周五的上午8：00按2 mL/kg的剂量灌胃
                                                             5×蛋白上样缓冲液后在金属浴 100 ℃下煮沸 10 min。
          50%CCl4溶液，连续8周。造模的同时，蓝盆花醇提物各
                                                             取变性后蛋白进行 SDS-PAGE 电泳（分离胶恒压 80 V、
          剂量组大鼠灌胃相应药液[以0.5%羧甲基纤维素钠（so‐
                                                             电泳时间30 min，浓缩胶恒压120 V、电泳时间90 min），
          dium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）溶液为溶剂]，空
                                                             然后在恒流200 mA的条件下湿转至0.45 μm NC膜（转
          白组和模型组大鼠灌胃等体积0.5%CMC-Na溶液，每天
                                                             膜时间根据蛋白分子量大小而定，每 1 kDa 约转膜 1
          下午4：00给药1次，连续8周。
                                                             min），加入5%脱脂奶粉在室温下封闭4 h；加入GAPDH
          2.3.2 样本取材及处理
                                                            （稀释比例为 1∶10 000）和 α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、
              末次给药结束后，禁食不禁水 12 h，麻醉并解剖大
                                                             Akt、PTEN一抗（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；
          鼠，取出肝脏，并用生理盐水进行肝脏灌流，观察肝脏形
                                                             TBST清洗3次，加入二抗（稀释比例为1∶1 000），室温孵
          态特征。将部分肝组织放入 4% 多聚甲醛中固定 48 h，
          剩余肝组织则放入冻存管中于－80 ℃冰箱中保存。                           育1 h。再次用TBST清洗3次后显影条带，用Image J软
          2.3.3 大鼠肝组织病理形态学观察                                 件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH蛋白条带
             （1）HE染色检测。取“2.3.2”项下经4%多聚甲醛固                    灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。
                                                             2.4 体外细胞实验
          定的肝组织样本，常规制备石蜡切片（厚度为4 μm）后，
          行常规HE染色，然后在显微镜下观察肝组织病理形态。                          2.4.1 蓝盆花醇提物含药血清对细胞中miRNA-21表达
             （2）Masson 染色检测。取“2.3.2”项下经 4% 多聚甲               的影响
          醛固定的肝组织样本，常规脱蜡后，按照Masson染色试                            用含10%胎牛血清的高糖培养基将HSC-T6细胞常
          剂盒说明书操作进行染色，每组选取3个不同的视野，在                          规培养至对数生长期。将对数生长期细胞接种至6孔板
                                                                          4
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          显微镜下进行观察。细胞质、肌纤维及红细胞染色后呈                           中（每孔 5×10 ～1×10 个细胞），实验设置对照组和蓝
          红色，胶原染色后呈蓝色。使用 Image J 软件对 Masson                  盆花醇提物含药血清低、中、高浓度组（将大鼠含药血清
          染色阳性区域的胶原面积进行分析，并计算胶原百分比                           稀释至 10%、15%、20%，浓度根据本课题组前期预实验
          [胶原百分比＝胶原阳性区域面积/总面积×100%]。                         结果设置），每组设置 3 个复孔。常规培养细胞至贴壁
          2.3.4 大鼠肝组织中HF指标及PI3K/Akt信号通路相关                    后，给予空白血清/含药血清干预 24 h。采用 Trizol 法提
          mRNA表达的检测                                          取各组细胞的总 RNA，以U6 为内参，采用 RT-PCR 法检
              采用 RT-PCR 法检测。取“2.3.2”项下冻存的肝组                  测 miRNA-21 的表达水平，具体检查条件同“2.3.4”项。
          织，常规解冻后，用Trizol法提取肝组织中总RNA，测定                      其中 ，内参 U6 的引物序列为 5′-AGAGAAGATTAG-
          其 浓 度 和 纯 度 后 ，将 RNA 逆 转 录 为 cDNA，然 后 以            CATGGCCCCTG-3′，扩增产物长度为23 bp；miRNA-21
          cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系如下：95 ℃预变                       的引物序列为 5′-TGTGGTAGCTTATCAGACTGATG-
          性15 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40个循             TTG-3′，扩增产物长度为26 bp。实验重复3次。


          中国药房  2024年第35卷第3期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 3    · 279 ·
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