Page 75 - 《中国药房》2024年2期
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transition,EMT)关系密切,当 EMT 发生后,肿瘤细胞更                2.2 安罗替尼对T98G细胞恶性表型影响的考察
          具侵袭力,可进一步入侵周围组织、血管及淋巴管等,                           2.2.1 细胞增殖活力
                                                                                          5
                           [3]
          从而发生远处转移 。核因子 κB(nuclear factor-κB,                    取对数生长期细胞,以2×10 个/mL接种至96孔板
          NF-κB)信号通路是经典的信号转导通路,能参与调控                         中,每孔 100 μL。将细胞分为对照组、安罗替尼不同浓
          肿瘤细胞迁移、侵袭、EMT、血管生成等过程                [4―5] 。可见,    度、阳性对照组,每组设置3个复孔。对照组细胞不进行
                                                             干预;安罗替尼不同浓度组细胞分别用5、10、20 μmol/L
          阻断 NF-κB 信号通路可作为改善肿瘤细胞恶性表型的
                                                                        [6]
                                                             的安罗替尼 进行干预;阳性对照组细胞用 50 mg/L 的
          重要途径。基于此,本研究拟探讨安罗替尼调控NF-κB
                                                                       [7]
                                                             5-氟尿嘧啶 进行干预;同时,设置不加细胞的调零孔作
          信号通路对人脑胶质瘤细胞 T98G 黏附、迁移、侵袭及
                                                             为空白组。培养24 h后,每孔加入CCK-8溶液10 μL,孵
          EMT样进程的影响,旨在为该药治疗脑胶质瘤提供理论
                                                             育2 h后,使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密
          依据。
                                                             度(OD)值,并按下式计算细胞增殖活力:细胞增殖活
          1 材料                                               力=(OD 实验组-OD 空白组 )/(OD 对照组-OD 空白组 )。
          1.1 主要仪器                                           2.2.2 细胞黏附能力
              本研究所用主要仪器包括 MCO18AIC 型 CO2培养                       将 20 μg/mL 的 rFN(以不含胎牛血清的 DMEM-H
          箱(日本 SANYO 公司)、Multiskan FC 型酶标仪(美国                培养基稀释)铺于 96 孔板中,风干后用磷酸盐缓冲液
          Thermo Fisher Scientific 公司)、WMS-1033 型倒置荧光       (PBS)洗涤20 min×3次,备用。取对数生长期细胞,以
                                                                  5
          显微镜(上海无陌光学仪器有限公司)、FluorChem HD2                    2×10 个/mL接种至6孔板中,每孔50 μL。按“2.2.1”项
          型凝胶成像系统(美国ProteinSimple公司)等。                       下方法分组、处理。培养24 h后,收集各组细胞,用胰蛋
                                                                                            4
          1.2 主要药品与试剂                                        白酶消化并制成单细胞悬液(1×10 个/mL)。取上述单
              安罗替尼对照品(货号 S8726,纯度≥98%)购自美                    细胞悬液 100 μL,接种至上述铺有 rFN 的 96 孔板中,于
          国 Selleck Chemicals 公司;5-氟尿嘧啶对照品(阳性对               37 ℃培养 1 h;以 PBS 洗涤 3 次,以甲醇固定 10 min 后,
                                                             用结晶紫染液染色15 min;再以PBS洗涤3次,于显微镜
          照,货号 S17073-5g,纯度≥98%)、NF-κB 通路抑制剂
                                                             下观察细胞黏附情况并记录黏附细胞(呈紫色)数。
          BAY 11-7082 对照品(批号 J07HS173399,纯度≥98%)
                                                             2.2.3 细胞迁移和侵袭能力
          均购自上海源叶生物科技有限公司;NF-κB通路激活剂
                                                                 取对数生长期细胞,以 2×10 个/mL 接种至 6 孔板
                                                                                          5
          prostratin 对照品(批号 0000112801,纯度≥98%)购自上
                                                             中,每孔 300 μL。按“2.2.1”项下方法分组、处理。待细
          海阿拉丁生化科技股份有限公司;胎牛血清购自美国
                                                             胞融合至 90% 时,用 200 μL 移液器枪头在每孔底部中
          Gibco公司;DMEM-H培养基购自北京索莱宝科技有限
                                                             央划一直线。分别于培养 0、24 h 时用显微镜观察并拍
          公司;RIPA 裂解液、CCK-8 试剂盒均购自日本 Dojindo                 照,记录对应的划痕面积(S0 h、S24 h ),并按下式计算细胞
          公司;重组人纤维连接蛋白(recombinant human fibro‐              迁移率:细胞迁移率=(S0 h-S24 h )/S0 h×100%。
          nectin,rFN)购自武汉爱博泰克生物科技有限公司;鼠源                         取对数生长期细胞,以不含胎牛血清的 DMEM-H
          NF-κB p65、磷酸化 NF-κB p65(phosphorylated NF-κB       培养基制成单细胞悬液(1×10 个/mL),取上述单细胞
                                                                                        5
          p65,p-NF-κB p65)、上皮钙黏着蛋白(E-cadherin)、神经            悬液0.25 mL,置于Transwell小室(需用基质胶处理5 h)
          钙黏着蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纤维连               上层;取含 10% 胎牛血清的 DMEM-H 培养基 0.45 mL,
          接蛋白(fibronectin,FN)、β-肌动蛋白(β-actin)抗体和辣            置于 Transwell 小室下层。上室细胞按“2.2.1”项下方法
          根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 IgG 二抗(批号分别为                         分组、处理。培养24 h后,弃去上清液,穿膜细胞用PBS
          10021394、10021309、20000374、10010628、10017978、      清洗3次,以4%甲醇固定30 min后晾干;用0.1%结晶紫
          10016772、20000374、20000425)均购自武汉三鹰生物技              染液染色10 min,用PBS清洗3次,晾干。使用显微镜观
                                                             察、拍照(每孔随机选择 5 个不同区域),并使用 Image J
          术有限公司。
                                                             图像分析软件记录侵袭细胞(呈紫色)数。
          1.3 细胞
                                                             2.2.4 细胞EMT相关蛋白的表达情况
              人脑胶质瘤细胞T98G(编号338721)购自商城北纳
                                                                                          5
                                                                 取对数生长期细胞,以 2×10 个/mL 接种至 6 孔板
          创联生物科技有限公司。
                                                             中,每孔 300 μL。按“2.2.1”项下方法分组、处理。培养
          2 方法                                               24 h 后,收集各组细胞,提取其蛋白后,进行定量、变性
          2.1 人脑胶质瘤T98G细胞培养                                  处理。取变性蛋白适量,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰
              取 T98G 细胞,复苏后接种于 DMEM-H 培养基(含                  胺凝胶电泳分离后转膜,封闭2 h;以TBST缓冲液洗膜,
          10% 胎牛血清、1% 青-链霉素)中,于 37 ℃、5%CO2条件                 加入 E-cadherin、N-cadherin、vimentin、FN、β-actin 一抗
          下培养(培养条件下同),当细胞贴壁至80%~90%时进                       (稀释比例分别为 1∶2 000、1∶10 000、1∶2 000、1∶2 000、
          行传代,取第3代对数生长期细胞用于后续实验。                             1∶ 2 000),4 ℃下孵育过夜;以 TBST 缓冲液洗膜,加入


          中国药房  2024年第35卷第2期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 2    · 193 ·
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