Page 53 - 《中国药房》2024年1期

下方法转染、分组、给药、处理，然后按“2.3.1”项下方法 5-FU 处理 24 h 后，MG63 细胞的增殖抑制率分别为
检测其凋亡率。 （6.49±0.37）% 、（15.72±1.41）% 、（29.34±2.75）% 、
2.6 氧化苦参碱对MG63细胞中COX-2表达的影响考察 （47.19±3.92）% 、（62.51±2.68）% 、（74.45±5.03）% 、
采用免疫荧光染色法检测。取对数生长期的MG63 （55.80±3.95）%（n＝6），均 较 对 照 组 显 著 升 高（P＜
5
细胞，按2×10 个/mL的密度接种于含细胞爬片的24孔
0.05）。氧化苦参碱作用于 MG63 细胞 24 h 的 IC50 为
板中，然后分为对照组和氧化苦参碱2.0、4.0、8.0 mg/mL
8.71 mg/mL。
组（质量浓度依据“2.2”项下结果设置），每组设 3 个复
3.2 氧化苦参碱对MG63细胞凋亡的影响
孔。培养 24 h 后收集各组细胞，经固定、透化和封闭后
3.2.1 细胞凋亡率
加入 COX-2 一抗（稀释度为 1∶200），4 ℃孵育过夜；以
与对照组比较，氧化苦参碱各浓度组和 5-FU 组细
PBS 洗涤后，加入 Alexa Fluor 594 标记的山羊抗兔 IgG
®
胞凋亡率均显著升高（P＜0.05）。结果见图1（5-FU组图
荧光二抗（稀释度为 1∶100），避光孵育 1 h，以 DAPI 染
色。采用数字玻片扫描系统扫描，采用 Image J 软件对 略）、表1。
COX-2 蛋白的荧光强度进行测定，该数值越大，表示目 10 3 10 3
的蛋白的阳性表达越强。 10 2 10 2
2.7 COX-2 过 表 达 对 氧 化 苦 参 碱 干 预 MG63 细 胞 PI PI
10 1 10 1
PINK1/Parkin信号通路和线粒体膜电位的影响考察
10 0 10 0
2.7.1 细胞处理及分组
5
取对数生长期的 MG63 细胞，按 5×10 个/mL 的密 10 0 10 1 10 2 10 3 10 0 10 1 10 2 10 3
度接种于 6 孔板中，根据细胞感染复数（multiplicity of Annexin Ⅴ-FITC Annexin Ⅴ-FITC
A.对照组 B.氧化苦参碱2.0 mg/mL组
infection，MOI）加入相应量的 Lenti-GFP 和 Lenti-COX- 10 3 10 3
2-GFP 慢病毒（根据前期预实验结果确定最佳 MOI 为
10 2 10 2
20）进行感染；培养3～4 d后更换为含嘌呤霉素（2 mg/L）的 PI PI
培养基，用于构建空载对照（感染 Lenti-GFP）和 COX-2 10 1 10 1
过表达（感染Lenti-COX-2-GFP）细胞株。具体实验分组 10 0 10 0
如下：对照组（空载对照细胞）、氧化苦参碱组（8.0 mg/mL
氧化苦参碱处理空载对照细胞）、COX-2组（COX-2过表 10 0 10 1 10 2 10 3 10 0 10 1 10 2 10 3
Annexin Ⅴ-FITC Annexin Ⅴ-FITC
达细胞）、COX-2+氧化苦参碱组（8.0 mg/mL氧化苦参碱 C.氧化苦参碱4.0 mg/mL组 D.氧化苦参碱8.0 mg/mL组
处理COX过表达细胞），药物处理时间为24 h。 图1 各组细胞凋亡的流式图
2.7.2 细胞中COX-2、PINK1和Parkin蛋白表达的检测
表1 各组细胞凋亡率以及 Bax、Bcl-2 蛋白表达水平的
采用 Western blot 法检测。取对数生长期的 MG63
检测结果（x±s，n＝3）
5
细胞，按 2×10 个/mL 的密度接种于 24 孔板中，再按
组别 细胞凋亡率/% Bax/β-actin Bcl-2/β-actin
“2.7.1”项下方法分组与处理，每组设 3 个复孔，然后按
对照组 3.15±0.28 0.214±0.016 0.813±0.041
“2.3.2”项下方法检测各组细胞中 COX-2、PINK、Parkin 氧化苦参碱2.0 mg/mL组 12.27±0.95 a 0.485±0.030 a 0.532±0.038 a
蛋白（一抗稀释度均为1∶1 000）表达水平。 氧化苦参碱4.0 mg/mL组 25.83±1.64 a 0.647±0.045 a 0.351±0.022 a
氧化苦参碱8.0 mg/mL组 34.52±1.86 a 1.077±0.068 a 0.289±0.015 a
2.7.3 细胞线粒体膜电位变化的检测 5-FU组 39.14±2.03 a 1.119±0.057 a 0.118±0.011 a
采用流式细胞术检测。取对数生长期的 MG63 细
a：与对照组比较，P＜0.05。
5
胞，按 2×10 个/mL 的密度接种于 24 孔板中，然后按
3.2.2 细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达水平
“2.7.1”项下方法分组与处理，每组设 3 个复孔，再按
与对照组比较，氧化苦参碱各浓度组和 5-FU 组细
“2.4.1”项下方法检测其线粒体膜电位降低比例。
2.8 统计学方法 胞中 Bax 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋
采用 SPSS 19.0 软件对数据进行统计学分析，计量 白表达水平均显著降低（P＜0.05）。结果见图2、表1。
资料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进 3.3 氧化苦参碱对MG63细胞线粒体自噬的影响
一步组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。 3.3.1 细胞线粒体膜电位降低比例
3 结果 与对照组比较，氧化苦参碱各浓度组和 5-FU 组细
3.1 氧化苦参碱对MG63细胞增殖的影响 胞的线粒体膜电位降低比例均显著升高（P＜0.05）。结
经 1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 mg/mL 氧化苦参碱和 果见表2。

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