Page 52 - 《中国药房》2024年1期
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2.2 氧化苦参碱对MG63细胞增殖的影响考察 体膜电位降低比例＝线粒体膜电位降低的细胞数/细胞
采用MTT法检测。取对数生长期的MG63细胞，按 总数×100%。
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5×10 个/mL的密度接种于96孔板中，将细胞分为空白 2.4.2 细胞线粒体自噬水平检测
组（只含培养基）、对照组（不含药物，含细胞、培养基）、 采用免疫荧光染色法检测。取对数生长期的MG63
氧化苦参碱不同质量浓度组（1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 细胞悬液（1×10 个/mL）制备细胞爬片，然后按“2.3.1”
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mg/mL，质量浓度根据前期预实验结果设置）和 5-FU 组 项下方法分组和给药，每组设3个复孔。培养24 h后收
（6 μmol/L，阳性对照组，浓度根据前期预实验结果设 集各组细胞，以4%多聚甲醛固定10 min，然后以PBS洗
置），每组设6个复孔。培养24 h后每孔加入5 mg/mL的 涤 3 次；加入 0.1% Triton X-100 透化 15 min，以 5% 牛血
MTT 工作液 10 μL；继续培养 4 h 后弃掉上清液，加入 清白蛋白室温封闭 1 h；加入 LC3、COX Ⅳ一抗（稀释
DMSO 100 μL，置于摇床振荡 10 min。采用酶标仪在 度均为 1∶200），4 ℃孵育过夜，以 PBS 洗涤 3 次；分别
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490 nm波长处检测吸光度（A），计算细胞增殖抑制率：细 加 入 Alexa Fluor 488 标 记 的 山 羊 抗 鼠 IgG 和 Alexa
®
胞增殖抑制率＝（A 对照组－A 给药组）/（A 对照组－A 空白组）×100%， Fluor 594 标记的山羊抗兔 IgG 荧光二抗（稀释度均为
然后通过CurveExpert软件计算半数抑制浓度（IC50 ）。 1∶100）避光孵育1 h；以DAPI染核5 min，PBS洗涤3次，
2.3 氧化苦参碱对MG63细胞凋亡的影响考察 采用激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体自噬情况。细
2.3.1 细胞凋亡率的检测 胞核经 DAPI 染色后呈蓝色，以 LC3 蛋白（红色）与线粒
采用流式细胞术检测。取对数生长期的 MG63 细 体标志蛋白COX Ⅳ（绿色）的共定位（黄色）细胞数量表
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胞，按2×10 个/mL的密度接种于6孔板中，将细胞分为 示线粒体自噬水平。
对照组（不含药物，含细胞、培养基）和氧化苦参碱 2.0、 2.4.3 细胞中PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ蛋白表达的检测
4.0、8.0 mg/mL组（质量浓度根据“2.2”项下结果设置）和 采用 Western blot 法检测。取对数生长期的 MG63
5-FU组（6 μmol/L），每组设3个复孔。培养24 h后收集 细胞，按“2.3.2”项下方法接种、分组（每组设3个复孔）、
各组细胞，按 Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明 给药和处理，检测细胞中 PINK1、Parkin 和 LC3-Ⅱ蛋白
书操作，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。 （一抗稀释度均为1∶1 000）的表达水平。
2.3.2 细胞中凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达水平检测 2.5 线粒体自噬对氧化苦参碱致 MG63 细胞凋亡的影
采用 Western blot 法检测。取对数生长期的 MG63 响考察
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细胞，按 5×10 个/mL 的密度接种于 6 孔板中，然后按 2.5.1 细胞分组及处理
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“2.3.1”项下方法分组和给药，每组设3个复孔。培养24 取对数生长期的 MG63 细胞，按 2×10 个/mL 的密
h后收集各组细胞，向细胞中加入RIPA裂解液以提取总 度接种于24孔板中，当细胞融合度达50%时，按照转染
蛋白，并用 BCA 试剂盒进行蛋白定量分析。蛋白变性 试剂说明书方法，分别用 NC siRNA 和 PINK1 siRNA 转
后，取 20 μg 在 100 V 恒压条件下进行十二烷基硫酸钠- 染 MG63 细胞。转染 24 h 后，将细胞分为对照组（只转
聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在恒流 300 mA 条件下转 染NC siRNA）、PINK1 siRNA组（只转染PINK1 siRNA）、
膜 100 min，室温封闭1 h；分别加入Bax、Bcl-2、β-actin一 氧化苦参碱组（转染NC siRNA后，再用8.0 mg/mL的氧
抗（稀释度分别为 1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃孵育 化苦参碱处理，质量浓度根据“2.2”项下结果设置）、
过夜；加入 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗（稀释度为 PINK1 siRNA+氧化苦参碱组（转染PINK1 siRNA后，再
1∶1 000），室温孵育1 h后，利用ECL发光液显色。采用 用8.0 mg/mL的氧化苦参碱处理），每组设3个复孔。
Image J软件进行分析，以目的蛋白与内参β-actin蛋白的 2.5.2 转染后细胞中PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ蛋白表达水
灰度值比值表示蛋白表达水平。 平的检测
2.4 氧化苦参碱对MG63细胞线粒体自噬的影响考察 采用 Western blot 法检测。将 MG63 细胞按“2.5.1”
2.4.1 细胞线粒体膜电位变化的检测 项下方法转染、分组、给药、处理，然后按“2.3.2”项下方
采用流式细胞术检测。取对数生长期的 MG63 细 法检测细胞中 PINK1、Parkin 和 LC3-Ⅱ蛋白（稀释度均
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胞，按 2×10 个/mL 的密度接种于 6 孔板中，然后按 为1∶1 000）的表达水平。
“2.3.1”项下方法分组和给药，每组设3个复孔。培养24 2.5.3 转染后细胞线粒体膜电位变化的检测
h后收集各组细胞，每孔中加入JC-1染液（工作浓度为1 采用流式细胞术检测。将 MG63 细胞按“2.5.1”项
μg/mL）1 mL，避光孵育 20 min；以磷酸盐缓冲液（PBS） 下方法转染、分组、给药、处理，然后按“2.4.1”项下方法
洗涤 2 次后加入新鲜培养液（不含血清和青-链霉素）1 检测其线粒体膜电位降低比例。
mL 重悬细胞，通过流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位 2.5.4 转染后MG63细胞凋亡率的检测
的变化，并计算细胞线粒体膜电位降低比例：细胞线粒 采用流式细胞术检测。将 MG63 细胞按“2.5.1”项
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