Page 59 - 《中国药房》2023年24期
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min后吸弃上清液，将细胞分为阳性对照组、阴性对照组                         下培养过夜，使其贴壁生长。次日，吸弃培养基，加入
          和不同浓度 IVQKIKHCF 组，每组设 3 个复孔。阳性对                    pH7.4 且含 5 ng/mL Fluo-3 AM 的钙成像缓冲溶液（cal‐
          照组加入 3 μmol/L 的 SP 溶液 100 μL；阴性对照组加入               cium imaging buffer，CIB），于37 ℃下孵育30 min。吸弃
          台式缓冲液 100 μL；不同浓度 IVQKIKHCF 组加入 25、                上清液，细胞以 CIB 清洗 2 次后，将 MRGPRX2/HEK293
          50、100 μmol/L的IVQKIKHCF溶液各100 μL。于37 ℃             细 胞 分 为 阳 性 对 照 组 、空 白 对 照 组 、不 同 浓 度
          下培养30 min后，以1 500 r/min离心5 min，取上清液50              IVQKIKHCF组，将HEK293细胞作为阴性对照组，每组
          μL，加入氘代组胺（内标）溶液100 μL，振荡10 s；于4 ℃                  设置 3 个复孔。阳性对照组加入 3 μmol/L 的 SP 溶液
          下以 12 000 r/min 离心 10 min，吸取上清液 50 μL，采用           100  μL；空 白 对 照 组 加 入 CIB  100  μL；不 同 浓 度
          液相色谱-串联质谱法定量分析各组细胞的组胺释放                            IVQKIKHCF 组加入 25、50、100 μmol/L 的 IVQKIKHCF
          量，具体检测条件和计算方法见已发表文献[16]。                           溶 液 各 100  μL；阴 性 对 照 组 加 入 100  μmol/L 的
          2.4 炎症因子释放量的测定                                     IVQKIKHCF 溶液 100 μL。随后，立即使用倒置荧光显
                                5
              将LAD2细胞按1×10 个/孔均匀接种于96孔板（每                    微镜观察各组细胞荧光强度的动态变化情况（每秒拍照
          孔100 μL）中，于37 ℃下培养过夜；以1 500 r/min离心5               1 张，共拍照 120 s），以反映细胞内钙离子浓度的变化
          min后吸弃上清液，将细胞分为阳性对照组、阴性对照组                         情况。
          和不同浓度 IVQKIKHCF 组，每组设 3 个复孔。阳性对                    2.7 统计学方法
          照组加入 3 μmol/L 的 SP 溶液 100 μL；阴性对照组加入                   采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。所有数
          台式缓冲液 100 μL；不同浓度 IVQKIKHCF 组加入 25、                据均采用 x±s 表示，两组样本的比较采用独立样本 t 检
          50、100 μmol/L的IVQKIKHCF溶液各100 μL。于37 ℃             验；多组样本的比较采用单因素方差分析（one-way
          下孵育8 h后，以1 500 r/min离心5 min，取上清液，严格                ANOVA），进一步两两比较采 Dunnett’s（方差不齐）或
          按照相应试剂盒说明书操作，采用ELISA法以酶标仪检                         LSD-t（方差齐）检验。检验水准α＝0.05。
          测各组细胞上清液中炎症因子（TNF-α、IL-8、MIP-1β、                   3 结果
          MCP-1）的含量。                                         3.1 IVQKIKHCF激活LAD2细胞引发脱颗粒反应
          2.5 敲低 MrgprX2 对细胞 β-氨基己糖苷酶释放率的                        SP 和 25～100 μmol/L 的 IVQKIKHCF 均可显著提
          影响                                                 高 LAD2 细胞的 β-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放量
              取 MrgprX2  siRNA 片 段 75  pmol 和 Lipofectamine   （P＜0.05），其中 β-氨基己糖苷酶的平均释放率由 25
          2000 转染试剂 7.5 μL，分别稀释于 Opti-MEM 培养基                μmol/L  IVQKIKHCF 组 的 19.92% 升 高 至 100  μmol/L
          100 μL中，静置2 min后，将上述两者混匀，室温静置15                    IVQKIKHCF 组 的 60.69%，组 胺 的 平 均 释 放 量 由 25
                                 6
          min；将 LAD2 细胞以 1×10 个/孔接种于 6 孔板中，加入                μmol/L IVQKIKHCF组的71.23 ng/mL升高至100 μmol/L
          MrgprX2 siRNA 和 Lipofectamine 2000 转染试剂的混合         IVQKIKHCF 组的 146.87 ng/mL，均有一定的剂量依赖
          液，混匀，得转染 MrgprX2 siRNA 片段的 LAD2 细胞                 趋势。结果见图1。
         （KD-LAD2 细胞），备用。取无序 siRNA 片段、Lipo‐                          100                           400
                                                                             β-氨基己糖苷酶
          fectamine 2000转染试剂和LAD2细胞，同法处理得转染                          80      组胺               a  a
          无序 siRNA 片段的 LAD2 细胞（NC-LAD2 细胞），备用。                       60                  a         300  （ ng/mL ）
          将上述两种细胞按1×10 个/孔接种于96孔板（每孔100                             β-氨基己糖苷酶释放率/%  40  a   a       200
                               5
          μL）中，于37 ℃下培养过夜；以1 500 r/min离心5 min后                                a  a    a            100  组胺释放量/
          吸弃上清液，将两种细胞均分为阳性对照组、阴性对照                                   20
          组和不同浓度 IVQKIKHCF 组，每组设 3 个复孔。阳性                             0                             0
                                                                       阴性对照组    25               50               100  阳性对照组
          对照组加入 3 μmol/L 的 SP 溶液 100 μL；阴性对照组加                                IVQKIKHCF浓度/（μmol/L）
          入台式缓冲液 100 μL；不同浓度 IVQKIKHCF 组加入                      a：与阴性对照组比较，P＜0.05。
                                                             图1 各组LAD2细胞的β-氨基己糖苷酶、组胺释放情况
          25、50、100 μmol/L 的 IVQKIKHCF 溶液各 100 μL。于
                                                                  （n＝3）
          37 ℃下培养 30 min 后，按“2.2”项下方法测定并计算各
          组细胞的β-氨基己糖苷酶释放率。                                   3.2 IVQKIKHCF激活LAD2细胞释放炎症因子
          2.6 细胞内钙离子浓度的检测                                        与阴性对照组比较，100 μmol/L IVQKIKHCF 组和
              将 MRGPRX2/HEK293 细胞和 HEK293 细胞按 1×             阳性对照组细胞上清液中 TNF-α、IL-8 含量，50、100
            4
          10 个/孔分别接种于 96 孔板（每孔 100 μL）中，于 37 ℃               μmol/L IVQKIKHCF 组和阳性对照组细胞上清液中

          中国药房  2023年第34卷第24期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 24    · 2997 ·
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