Page 64 - 《中国药房》2023年24期
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2.2 RSV扩增                                           2.7 外周血淋巴细胞百分比检测
              待 HEP-2 细胞长成单层后，加入 RSV 病毒液 200                      取“2.5”项下各组小鼠外周血 100 μL，加入 CD8a、
          μL，吸附1 h后，加入2%DMEM维持液培养。当90%以                       CD3、CD4抗体各1.25 μL，涡旋混匀，于4 ℃下避光染色
          上细胞出现致细胞病变效应后，于－20 ℃与室温之间反                          20 min；加入7-氨基放线菌素D活性检测染料适量，孵育
          复冻融 3 次，以 4 000 r/min 离心 5 min，取上清液于离心              10 min；加入红细胞裂解液1 mL，涡旋混匀，于室温下静
          管中，于－80 ℃冻存，备用。                                     置15 min，以2 000 r/min离心5 min，弃去上清液；细胞加
          2.3 RSV半数细胞培养物感染量的测定                                入磷酸盐缓冲液2 mL，以2 000 r/min离心5 min，弃取上
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              将HEP-2细胞按1×10 个/L接种至96孔板中，培养                    清液；细胞以磷酸盐缓冲液200 μL重悬后转移至流式管
          24 h；加入以10倍比稀释12个滴度梯度的RSV病毒液，                       中，使用流式细胞仪进行检测其外周血淋巴细胞百
          每孔 100 μL，纵向重复 3 孔；同时，设置正常细胞（加入                     分比。
          等体积 10%DMEM 维持液）作为对照。培养 48 h，采用                     2.8 肺组织病理形态观察
          MTT 法以酶标仪于 490 nm 波长处测定各孔的光密度                           取“2.5”项下各组小鼠经固定的肺组织，进行脱水、
         （optical  density，OD）值 ，重 复 测 定 4 次 。 根 据 Reed-      透明、浸蜡、包埋、切片，经HE染色后，以中性树胶封片。
          Muench 公式 计算 RSV 半数细胞培养物感染量（me‐                     使用显微镜观察其肺组织病理形态变化并拍照。
                     [8]
          dian tissue culture infective dose，TCID50 ）。        2.9 小鼠肠道菌群基因测序
          2.4 小鼠分组、给药与造模                                          以 NC 组、MC 组、MDYY 组（前述药效学实验结果
              小鼠适应性饲养3 d后，按体重分为正常组（NC组，
                                                              显示中剂量达原饮药效最佳）小鼠的结肠内容物为检测
          生理盐水）、模型组（MC 组，生理盐水）、阳性对照组
                                                              样本，采用十六烷基三甲基溴化铵法提取样本的DNA，
         （LBM组，57.59 mg/kg利巴韦林，相当于临床等效剂量）
                                                              通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别确定所提
          和达原饮低、中、高剂量组（LDYY、MDYY、HDYY 组，
                                                              取DNA的质量和数量。以该DNA为模板，对16S rDNA
          剂量按生药量计分别为 1.67、3.34、6.68 g/kg，相当于临
                                                              V3～V4 区进行扩增，引物序列为 806R：GACTACHV-
          床等效剂量的0.5、1、2倍），每组6只。根据课题组前期
                                                              GGGTATCTAATCC；341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；
                  [9]
          研究方法 复制RSV寒湿郁肺证小鼠模型：除NC组外，
                                                                                                      [10]
                                                              序列方向长度为806R-341F，产物长度为465 bp 。PCR
          其余各组小鼠均置于温度（4±1）℃、相对湿度（90±
                                                              扩增产物通过 2% 琼脂糖凝胶电泳进行检测，并回收目
          5）%的人工气候箱中，每天 4 h，连续 5 d，寒湿造模期间
                                                              标片段；对纯化后的 PCR 产物进行评估，将合格的测序
          禁食、不禁水，刺激4 h后取出。第2次寒湿刺激结束后，
                                                              文库梯度稀释，根据所需测序量按相应比例混合，并经
          除 NC 组外的其余各组小鼠均吸入异氟烷麻醉，并鼻腔
                                                              NaOH 变性为单链后上机测序。得到原始下机数据后，
          滴注50倍TCID50的RSV病毒液60 μL，每天1次，连续3
                                                              利用Overlap软件将双端数据进行拼接，并进行质控、嵌
          d；NC组小鼠同法滴鼻等体积生理盐水。各药物组小鼠
                                                              合体过滤。测序数据经过 DADA2 去噪后，利用扩增序
          每次滴鼻4 h后灌胃相应药液，NC组和MC组小鼠同法
                                                              列变体（amplicon sequence variants，ASVs）概念构建操
          灌胃等体积的生理盐水，每天1次，持续5 d。
                                                              作分类单元（operational taxonomic units，OTU）表，获得
          2.5 标本采集与处理
                                                              最终的ASVs特征表及特征序列并进行菌群α多样性分
              末次给药后，所有小鼠禁食、不禁水12 h，摘眼球取
                                                              析（Shannon、Simpson、Chao1、Goods_coverage 指数）、肠
          血并置于乙二胺四乙酸抗凝采血管和普通采血管中。
                                                              道结构分析和线性判别分析（linear discriminant analysis
          抗凝采血管中的血样用于流式检测；普通采血管中的血
                                                              effect size，LEfSe）。
          样于室温下静置2 h后，以3 000 r/min离心15 min，收集
                                                              2.10 统计学方法
          上层血清，于－80 ℃保存，备用。取血后，收集小鼠结肠
          内容物于无菌冻存管中，于－80 ℃保存，备用。然后，处                             采用 GraphPad Prism 8.0.2 软件进行统计分析和作
          死小鼠，开胸剖取肺组织，将其左小叶用4%多聚甲醛浸                           图。数据以x±s表示，对于符合正态分布且方差齐的数
          润、固定；取其右肺最大叶称重后加入适量磷酸盐缓冲液，                          据，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用
          匀浆后以3 000 r/min离心10 min，收集上清液，于－80 ℃                LSD-t检验；对于非正态分布或者方差不齐的数据，组间
          保存，备用；其余肺组织于－80 ℃下保存，备用。                            比较采用非参数秩和检验。检验水准α＝0.05。
          2.6 血清中胃肠激素水平和肺组织上清液中炎症因子                           3 结果
          水平测定                                                3.1 达原饮对小鼠血清胃肠激素水平和肺组织上清液
              取“2.5”项下各组小鼠血清和肺组织上清液，严格按                       中炎症因子水平的影响
          照ELISA试剂盒说明书操作，使用酶标仪检测其血清胃                              与 NC 组比较，MC 组小鼠血清中 MTL 水平和肺组
          肠激素（MTL、GAS）水平和肺组织上清液中炎症因子                          织上清液中IL-6、IL-1β水平均显著升高，血清中GAS水
         （IL-6、IL-1β）水平。                                      平显著降低（P＜0.01）。与MC组比较，各药物组小鼠血


          · 3002 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 24                            中国药房  2023年第34卷第24期
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