Page 58 - 《中国药房》2023年24期
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喹诺酮类等小分子药物均可通过直接激活 MRGPRX2                          生物技术有限公司；MrgprX2 干扰小 RNA（small interfe-
          而引发类过敏反应         [10―11] ；此外，艾替班特、奥曲肽、西曲            ring RNA，siRNA）片段和作为阴性对照的无序siRNA片
          瑞克等多肽药物也被证实可通过 MRGPRX2 激活肥大                         段均由苏州吉玛基因股份有限公司设计、合成，前者上、
          细胞而引发皮疹、瘙痒甚至过敏性休克等类过敏反应症                            下游序列分别为 5′-GUACAACAGUGAAUGGAAATT-
          状，表明MRGPRX2是介导多肽药物致类过敏反应的关                          3′、5′-UUUCCAUUCACUGUUGUACTT-3′，后者上、下
          键受体   [12―13] 。                                     游 序 列 分 别 为 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-
              为提高多肽药物的临床安全性、降低多肽药物临床                          3′、5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。
          试 验 的 失 败 率 ，多 项 研 究 针 对 多 肽 结 构 及 其 激 活            1.3 细胞
          MRGPRX2 的作用进行了评价，发现大多数可激活                               人肥大细胞系 LAD2 细胞由美国国立卫生研究院
          MRGPRX2的多肽具有相似的序列，包括带正电荷的氨                         （National Institutes of Health，NIH）赠予；人胚胎肾细胞
          基酸（如赖氨酸、精氨酸）和脂肪族氨基酸（如丙氨酸、缬                          系HEK293细胞和高表达MRGPRX2的人胚胎肾细胞系
          氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸）；同时，这类多肽在                          HEK293 细胞（MRGPRX2/HEK293 细胞）由赛业（广州）
          pH7.0 下通常带正电荷，且所含疏水氨基酸比例较                           生物科技有限公司提供。
          高 [14―15] 。本课题组前期基于 SP 等肽类物质开展了一系                   2 方法
          列结构分析及活性评价，构建了一个小分子肽（十一肽                            2.1 细胞培养
          以内）化合物库，并从中发现了一种可激活肥大细胞的                                将 LAD2 细胞接种于含有 Gln、100×青-链霉素双
                                                              抗、人干细胞生长因子和 StemPro-34 营养补液的 Stem‐
          九肽 IVQKIKHCF[由异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）、谷氨
          酰 胺（Gln）、赖 氨 酸（Lys）、组 氨 酸（His）、半 胱 氨 酸              Pro-34 培养基中 ，在 37 ℃、5%CO2 条件下培养。将
         （Cys）、苯丙氨酸（Phe）组成，即 H2N-Ile-Val-Gln-Lys-Ile-         HEK293 细胞和 MRGPRX2/HEK293 细胞分别接种于含
                                                              有胎牛血清和 100×青-链霉素双抗的 DMEM 培养基
          Lys-His-Cys-Phe-COOH]。在此基础上，本研究拟进一
                                                              中，在37 ℃、5%CO2条件下培养。
          步证实 IVQKIKHCF 对肥大细胞的激活作用是否与
                                                              2.2 β-氨基己糖苷酶释放率的测定
          MRGPRX2有关，旨在为多肽药物的设计与开发提供实
                                                                                     5
                                                                  将 LAD2 细胞按 1×10 个/孔接种于 96 孔板（每孔
          验基础。
                                                              100 μL）中，于 37 ℃下培养过夜；以 1 500 r/min 离心 5
          1 材料
                                                              min后吸弃上清液，将细胞分为阳性对照组、阴性对照组
          1.1 主要仪器
                                                              和不同浓度 IVQKIKHCF 组，每组设 3 个复孔。阳性对
              本研究所用主要仪器包括 MCO-15AC 型 CO2细胞
                                                              照组加入 3 μmol/L 的 SP 溶液 100 μL（以 pH7.4 的台式
          培养箱（日本Sanyo公司）、800TS型酶标仪（美国BioTek
                                                              缓冲液为溶剂，该浓度的 SP 具有明显的 MRGPRX2 激
          公司）、LCMS-8040型三重四极杆液质联用仪（日本Shi‐
                                                                    [10]
                                                              活效应 ，下同）；阴性对照组加入 pH7.4 的台式缓冲液
          madzu 公司）、Ti-U 型倒置荧光显微镜（日本 Nikon 公
                                                              100 μL；不同浓度IVQKIKHCF组加入25、50、100 μmol/L
          司）等。
                                                              的 IVQKIKHCF 溶液各 100 μL（以 pH7.4 的台式缓冲液
          1.2 主要药品与试剂
                                                              为溶剂，浓度依据前期预实验结果设置，下同）。于
              IVQKIKHCF[纯度 98%（经高效液相色谱法测定）]
                                                              37 ℃下培养30 min后，以1 500 r/min离心5 min，取各组
          由南京肽业生物科技有限公司合成、表征；胎牛血清购                            上清液 50 μL，加入 1 mmol/L 的 β-氨基己糖溶液[以 0.1
          自美国 Gibco 公司；DMEM 培养基购自美国 Corning 公                 mol/L柠檬酸溶液-0.1 mol/L柠檬酸钠溶液（26∶24，V/V）
          司；StemPro-34 培养基购自美国 Invitrogen 公司；Opti-            为溶剂]50 μL，于 37 ℃下孵育 90 min 后，加入终止液
          MEM培养基购自美国HyClone公司；100×青-链霉素双                      150 μL，于室温下振摇混匀2 min，使用酶标仪于405 nm
          抗购自依科赛生物科技（太仓）有限公司；SP购自西安易                          波长下检测各孔的光密度（OD）值。阴性对照组吸弃
          飞生物科技有限公司；β-氨基己糖、氘代组胺（内标）均                          剩余上清液，细胞加入 Trition-X 裂解液轻轻吹打后，以
          购自美国 Sigma-Aldrich 公司；Lipofectamine 2000 转染         2 000 r/min 离心 5 min，取细胞裂解上清液 50 μL，同法
          试剂、Fluo-3 AM/钙离子荧光探针均购自美国Invitrogen                 检测其OD值。按下式计算各组细胞的β-氨基己糖苷酶
                  ®
          公司；Q5 定点突变试剂盒购自美国 NEB 公司；人肿瘤                        释放率：β-氨基己糖苷酶释放率＝实验组细胞上清液
          坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介          OD 值/（阴性对照组上清液 OD 值+细胞裂解上清液 OD
          素 8（interleukin-8，IL-8）、巨噬细胞炎症蛋白 1β（macro‐          值）×100%。
          phage inflammatory protein-1β，MIP-1β）、单核细胞趋化        2.3 组胺释放量的测定
                                                                                     5
          蛋白 1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）酶联免           将 LAD2 细胞按 1×10 个/孔接种于 96 孔板（每孔
          疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒均购自北京义翘神州                          100 μL）中，于 37 ℃下培养过夜；以 1 500 r/min 离心 5


          · 2996 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 24                            中国药房  2023年第34卷第24期
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