Page 47 - 《中国药房》2023年23期
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食 。 另 外 80 只 小 鼠 通 过 高 脂 饮 食（其 中 蛋 白 质 占           2.3.3 尿微量白蛋白与肌酐比值测定
          18.14%，脂肪占 60.65%，碳水化合物占 21.21%）联合小                    给药后第4周，每组小鼠放进代谢笼，禁食，采集24 h
          剂量 STZ 建立糖尿病肾病小鼠模型 ，具体方法如下：                        尿量；按相应试剂盒说明书方法操作，分别检测小鼠尿
                                         [12]
          小鼠以相应饲料喂养6周后，禁食12 h，然后一次性腹腔                        微量白蛋白和尿肌酐水平，并计算两者的比值。
          注射5% STZ（50 mg/kg），注射后第3天检测小鼠空腹血                   2.4 小鼠肾组织氧化应激相关生化指标的检测
          糖，当空腹血糖＞16.7 mmol/L时，表明糖尿病模型造模                     2.4.1 小鼠肾组织中SOD、GSH-Px和MDA含量测定
              [13]
          成功 （共造模成功72只糖尿病小鼠）；进一步喂养相应                            “2.3.1”项下肾脏称重后，取一半按照质量体积比
          饲料10周后，收集糖尿病小鼠尿液，当24 h尿蛋白排泄                        1∶9（g/mL）加入生理盐水，2 000 r/min离心15 min，取沉
                                                   [13]
          量＞30 mg/dL时，表明糖尿病肾病模型造模成功 。最                       淀研磨制备肾组织匀浆，按相应试剂盒说明书方法操
          终共造模成功64只糖尿病肾病模型小鼠。                                作，检测小鼠肾组织中SOD、GSH-Px和MDA的含量。
              将 60 只造模成功的糖尿病肾病模型小鼠随机分为                       2.4.2 小鼠肾组织中8-OHdG含量测定
                                    [14]
          模型组、阳性对照组（维生素E ，20 mg/kg，剂量参考文                         采用免疫组化法进行检测。取“2.4.1”项下另一半
          献[6]设置）和 TAB 低、中、高剂量组（1、2、4 mg/kg，剂量               肾组织置于10%甲醛溶液固定48 h，经梯度乙醇脱水浸
          参考文献[4]设置），每组12只。各给药组小鼠灌胃相应
                                                             蜡后进行石蜡包埋、切片（5 μm）；取部分切片进行抗原
          药物，正常对照组及模型组小鼠灌胃等量生理盐水，连
                                                             热修复，5%山羊血清封闭非特异抗原，加入8-OHdG 一抗
          续4周。
                                                            （稀释度 1∶200），4 ℃孵育过夜；次日，以磷酸盐缓冲液
          2.2 小鼠糖代谢功能相关生化指标的检测
                                                            （PBS）清洗3次，加入相应二抗（稀释度为1∶5 000），37 ℃
          2.2.1 空腹血糖含量测定
                                                             孵育 30 min；以 PBS 清洗 3 次后，进行 DAB 显色和苏木
              TAB灌胃后，各组小鼠每周用75%乙醇对小鼠尾尖
                                                             素染色，然后经梯度乙醇脱水、透明、封片。采用荧光显
          消毒后，于尾静脉处利用血糖仪检测一次空腹血糖（检
                                                             微镜观察切片棕色或棕黑色的阳性区域。
          测前禁食禁水12 h）。
                                                             2.5 小鼠肾组织的PAS、Masson染色观察
          2.2.2 葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验
                                                                 将“2.4.2”项下剩余切片进行脱蜡水化，取部分切片
              葡萄糖耐量实验：给药后第4周，每组小鼠禁食不禁
                                                             进行PAS染色，基底膜、系膜基质、糖原及糖蛋白呈紫红
          水过夜后，称重，腹腔注射葡萄糖（1.5 g/kg）后，于0、15、
                                                             色，细胞核呈蓝色。另取部分切片进行 Masson 染色，
          30、60、120 min时尾静脉取血0.1 mL，然后检测血糖值，
                                                             ECM的胶原纤维被染成蓝色，肌纤维和细胞核则呈红色
          并计算葡萄糖耐量曲线下面积（area under curve，AUC）。
                                                             或粉红色。利用荧光显微镜观察肾组织纤维化程度，并
              胰岛素耐量实验：给药后第4周，每组随机选取6只
                                                             用ImageJ V1.8.0软件统计染色面积占比。
          小鼠禁食不禁水过夜后，称重，腹腔注射胰岛素（0.75
                                                             2.6 小鼠肾组织中 TGF-β1、Fn、Col Ⅳ、p-Akt、Nrf2 和
          U/kg）后，于0、15、30、60、120 min时尾静脉取血0.1 mL，
                                                             HO-1蛋白表达水平的检测
          然后检测血糖值，并计算胰岛素耐量AUC。
                                                                 采用 Western blot 法进行检测。使用液氮研磨 20
          2.2.3 血清胰岛素含量测定
                                                             mg肾组织，加入RIPA裂解液置于冰上30 min完全溶解
              给药后第4周，每组小鼠禁食过夜后，腹腔注射150
                                                             样品后，于 4 ℃条件下以 12 000 r/min 离心 20 min，收集
          mg/kg戊巴比妥钠处死，称重。取小鼠心尖血0.8 mL，以
          2 000 r/min离心10 min，收集上层血清，采用胰岛素试剂                 上清液进行 BCA 定量，然后进行变性处理。取变性后
          盒检测小鼠血清胰岛素含量。                                      的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
          2.3 小鼠肾脏系数和肾功能相关生化指标水平的检测                          和转膜，以 5% 脱脂牛奶室温封闭 1 h，加入 TGF-β1、Fn、
          2.3.1 肾脏系数                                         Col Ⅳ、p-Akt、Nrf2、HO-1、β-actin 一抗（稀释度均为 1∶
              给药后第 4 周，每组小鼠进行“2.2.3”项下心尖血取                   1 000），4 ℃孵育过夜；以 PBS 漂洗 3 次×5 min，加入相
          血后，解剖摘取肾脏，称重，计算肾脏系数：肾脏系数                           应二抗（稀释度为 1∶5 000），室温孵育 1 h；以 PBS 漂
         （mg/g）＝肾脏质量/体重。                                     洗 3 次×5 min；经显色处理后，进行凝胶成像。采用
          2.3.2 血清中尿酸、尿素氮和肌酐水平的测定                            ImageJ V1.8.0软件分析蛋白条带灰度值，以目标蛋白与
              给药后第 4 周，每组小鼠进行“2.2.3”项下心尖血取                   内参蛋白β-actin的灰度值比值表示蛋白的表达水平。
          血的同时利用眼球采血法收集血液，血样先置于 37 ℃                         2.7 统计分析
          条件下 1 h，再置于 4 ℃下过夜，待血液凝固后，以 2 000                      采用 SPSS 17.0 软件进行数据分析，计量资料采用
          r/min 离心 10 min，收集上层血清；按照相应试剂盒说明                   x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，进一步两
          书方法操作分别检测小鼠血清中尿酸、尿素和肌酐水平。                          两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。


          中国药房  2023年第34卷第23期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 23    · 2857 ·
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