Page 53 - 《中国药房》2023年22期
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铁死亡是一种由铁依赖性脂质活性氧（reactive oxygen                   数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、TargetNet
          species，ROS）异常累积所引发的非凋亡性程序性死亡                      数据库（http：//targetnet.scbdd.com/）、Batman-TCM 数据
          方式，与恶性肿瘤、神经退行性疾病等多种疾病密切相                           库（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中检索其可能
                                                       [5]
          关，并在肿瘤细胞生长、耐药等方面发挥着重要作用 。                          的作用靶点，合并、去重后，共筛选得到 VTM 预测靶点
          本课题组前期预实验证实，VTM可抑制GBM细胞的增                          16 397个。
          殖，但这种作用是否与铁死亡过程有关以及其具体作用                           2.1.2 GBM和铁死亡相关靶点获取
          机制尚不清楚。为此，本研究拟通过网络药理学方法预                               以“glioblastoma”“glioma”为关键词，在CTD数据库
          测 VTM 作用于 GBM 的潜在靶点、基因功能及信号通                      （https：//ctdbase.org/）、DrugBank 数据库（https：//go.drug‐
          路；同时，拟借助体外细胞实验，初步验证该成分通过诱                          bank.com/）、GeneCards 数据库（https：//www.genecards.
          导铁死亡来抑制 GBM 细胞活性的可能机制，以期为                          org/）、OMIM 数据库（https：//omim.org/）、PharmGKB 数
          GBM治疗和新药研究提供新思路。                                   据库（https：//www.pharmgkb.org/）、TTD 数据库（http：//
          1 材料                                               db.idrblab.net/ttd/）中进行检索，并在 PubMed 数据库
          1.1 主要仪器                                          （https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行补充检索，合
              本研究所用主要仪器包括3111型CO2细胞培养箱、                      并、去重后，共得到 GBM 疾病相关靶点 5 865 个。通过
          EVOSF1型荧光显微镜（美国Thermo Fisher Scientific公           FerrDb 数据库（http：//www.zhounan.org/ferrdb/）获取铁
          司），CKX41 型光学倒置显微镜（日本 Olympus 公司），
                                                             死亡相关靶点（ferroptosis-related genes，FRGs）1 043个。
          STNERGYH1 型酶标仪（美国 Agilent 公司），C6 型流式
                                                             2.1.3 VTM干预靶点的获取及富集分析
          细胞仪（美国 BD 公司），165-8001 型蛋白电泳仪、Chem
                                                                 将上述获取到的药物预测靶点、疾病相关靶点、
          Ⅰ Doc 型超高灵敏度化学发光成像系统（美国 Bio-Rad
                                                             FRGs进行交叉，利用R语言的“Venn”包进行分析，获取
          公司）等。
                                                             VTM 干预 GBM 的铁死亡相关交集靶点 462 个。利用
          1.2 主要药品与试剂                                        UniProt数据库（http：//www.uniprot.org）对上述交集靶点
              VTM 原料药（批号 HY-N0837，纯度 99.61%）、CCK-
                                                             进行标准化校正，运用 R 语言的“ClusterProfiler”包进行
          8试剂盒（批号HY-K0301）均购自美国MedChemExpress
                                                             基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析以及京都基
          公司；DMEM高糖培养基（批号2327860）、胎牛血清（批
                                                             因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and
          号 10091148）均购自美国 Gibco 公司；4% 多聚甲醛固定
                                                             Genomes，KEGG）信号通路富集分析，以P＜0.05为条件
          液（批号P0099）、结晶紫染色液（批号C0121）、胰酶消化
                                                             进行筛选并对富集基因数与总基因数的比值（简称“富
          液（批号C0201）、Western blot细胞裂解液（批号P0031）、
                                                             集基因占比”）进行排序（由大到小），再运用“ggplot2”包
          BCA 蛋白浓度测定试剂盒增强型（批号 P0009）、2′，7′-
                                                             对富集分析结果进行可视化展示，得到VTM干预GBM
          二 氯 荧 光 素 二 乙 酸 酯（DCFH-DA）荧 光 探 针（批 号
                                                             的主要功能及可能途径。
          S0033）均购自上海碧云天生物技术有限公司；Ferro-
                                                                 GO功能富集结果（图1）显示，VTM干预GBM的生
          Orange荧光探针（批号F374）购自东仁化学科技（上海）有
          限公司；兔源谷胱甘肽过氧化物酶 4（glutathione peroxi‐              物学过程（biological process，BP）主要涉及氧化应激、细
          dase 4，GPX4）单克隆抗体（批号 T56959）购自艾比玛特                 胞凋亡、对金属离子的响应、自噬调节等；细胞成分（cel‐
          医药科技（上海）有限公司；兔源血红素加氧酶 1（heme                       lular components，CC）主要涉及胞质囊泡、线粒体膜、细
          oxygenase 1，HO-1）单克隆抗体（批号 ab214039）、兔源             胞膜和核糖体等部位；分子功能（molecular function，
                                                                                           2+
          核转录因子红系2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-          MF）主要包括影响二价铁离子（Fe ）结合、DNA 转录过
          related factor 2，Nrf2）单克隆抗体（批号 ab137550）均购         程和多个氧化还原酶活性等。
          自 英 国 Abcam 公 司 ；兔 源 甘 油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶               KEGG 富集结果（图 2）显示，VTM 干预 GBM 主要
         （GAPDH）单克隆抗体（批号2118S）购自美国CST公司；                     涉及铁死亡、磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphoinositide 3-
          辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗（批号 ZB-                       kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，又称 Akt）、
          2306）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。                             自噬、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of ra‐
          1.3 细胞                                             pamycin，mTOR）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，
              人GBM细胞U251购自美国ATCC菌种保藏中心。                      TNF）、细胞凋亡等信号通路。
          2 方法与结果                                                GO 和 KEGG 富集分析结果显示，VTM 干预 GBM
          2.1 网络药理学分析                                        涉及多条信号通路，其中氧化应激和铁死亡信号通路均
          2.1.1 VTM作用靶点预测                                    排名靠前。基于此，本研究选择与氧化应激、铁死亡均
              以“VTM”为关键词，在PharmMapper数据库（http：//             相关的信号通路 Nrf2/HO-1/GPX4        [6―9] 作为后续研究的
          www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、SwissTargetPrediction  重点。


          中国药房  2023年第34卷第22期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 22    · 2735 ·
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