Page 41 - 《中国药房》2023年22期
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2.2 细胞培养液中炎症因子水平的检测                                94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 35 s，72 ℃延伸 35 s，共 40 个
              取对数生长期细胞，分为对照组、模型组和芒柄花                         循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，采用
          素不同浓度组（分别为 LPS+6.25 组、LPS+12.5 组、LPS+              2 －ΔΔCt 法检测目的基因的表达水平，结果以对照组为参照
          25组、LPS+50组），每组设置3个复孔。对照组细胞不进                      进行归一化处理。PCR引物序列及产物长度见表1。

          行任何干预，模型组细胞加入 1 μg/mL 的 LPS 刺激 24 h                          表1 PCR引物序列及产物长度
                                        [11]
          以构建体外肺泡上皮细胞损伤模型 ，芒柄花素不同浓                            目的基因        引物序列（5′→3′）               产物长度/bp
                                                              GAPDH       上游：TGACTTCAACAGCGACACCCA    251
          度组细胞同时加入 1 μg/mL 的 LPS 和 6.25、12.5、25、50                        下游：CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA
                                                      [5]
          μmol/L 的芒柄花素（芒柄花素浓度参考相关文献 设                         IL-8        上游：TCCAAACCTTTCCACCCC       147
                                                                          下游：CACAACCCTCTGCACCCA
          置）。培养24 h后，收集各组细胞培养液，按相应试剂盒
                                                              TNF-α       上游：AGCACTGAAAGCATGATCCGG    271
          说明书方法操作，采用ELISA法以酶标仪测定其中炎症                                      下游：CATGGGCTACAGGCTTGTCAC
          因子IL-8、TNF-α水平。                                    2.4.2 细胞凋亡率的检测
          2.3 细胞活力的检测                                            取对数生长期细胞，按“2.4.1”项下方法分组、处理。
              取对数生长期细胞，按“2.2”项下方法分组、处理。                      培养 24 h 后，收集各组细胞，以磷酸盐缓冲液洗涤 5
          培养 24 h 后，收集各组细胞，加入 CCK-8 溶液 10 μL，孵               min×2 次后，置于 4 ℃的 4% 多聚甲醛中固定 10 min。
          育2 h后，使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密                       取出细胞，洗涤 3 次，以 5 mg/L 的 Hoechst 33258 染液染
          度（OD）值并按下式计算细胞活力：细胞活力＝实验组                          色 10 min；洗涤 3 次，封片，使用荧光显微镜观察、拍照，
          细胞OD值/对照组细胞OD值×100%。                               并按下式计算细胞凋亡率：细胞凋亡率＝凋亡细胞数/总
          2.4 基于PI3K/Akt信号通路的机制分析                            细胞数×100%（凋亡细胞呈亮蓝色且染色不均，核固缩

          2.4.1 IL-8、TNF-α分泌水平和mRNA表达水平的检测                   变小）。
              取对数生长期细胞，分为对照组、模型组、芒柄花素                        2.4.3 细胞中PI3K/Akt信号通路关键蛋白表达的检测
          组（LPS+25 组）、抑制剂组、芒柄花素+抑制剂组和芒柄                          取对数生长期细胞，按“2.4.1”项下方法分组、处理。
          花素+激活剂组，每组设置 3 个复孔。对照组细胞不进                         培养24 h后，收集各组细胞，提取其蛋白，定量后经高温
          行任何干预，模型组细胞加入 1 μg/mL 的 LPS 刺激 24 h                水浴变性。取变性蛋白适量，进行十二烷基硫酸钠-聚
                                        [11]
          以构建体外肺泡上皮细胞损伤模型 ，LPS+25组细胞同                        丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后封闭 2 h；加入 PI3K、Akt、
          时加入 1 μg/mL 的 LPS 和 25 μmol/L 的芒柄花素（芒柄             p-Akt、p-PI3K、β-actin 一抗（稀释比例分别为 1∶3 000、
          花素浓度参考“2.2”“2.3”项下结果设置，下同），抑制剂                     1∶10 000、1∶5 000、1∶1 000、1∶5 000），于 4 ℃下孵育过
          组细胞同时加入 1 μg/mL 的 LPS 和 20 μmol/L 的 PI3K/          夜；用 TBST 缓冲液洗膜，加入相应 IgG 二抗（稀释比例
          Akt 通路抑制剂 LY294002（抑制剂浓度参考相关文献               [12]  为1∶2 000），孵育2 h；用TBST缓冲液洗膜，显影后使用
          设置，下同），芒柄花素+抑制剂组细胞同时加入1 μg/mL                      凝胶成像系统成像。使用Image J 1.8.0软件分析蛋白条
          的 LPS、25 μmol/L 的芒柄花素和 20 μmol/L 的 PI3K/Akt        带的灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带的灰
          通路抑制剂LY294002，芒柄花素+激活剂组细胞同时加                       度值比值作为目的蛋白的相对表达量。
          入 1 μg/mL 的 LPS、25 μmol/L 的芒柄花素和 10 μmol/L         2.5 统计学方法
          的 PI3K/Akt 通路激活剂 SC79（激活剂浓度参考相关文                       采用 SPSS 26.0 软件对数据进行统计分析，采用
            [13]
          献 设置）。培养24 h后，收集各组细胞培养液，按“2.2”                     GraphPad Prism 8 软件作图。计量资料以 x ˉ± s 表示，多
          项下 ELISA 法检测其中炎症因子 IL-8、TNF-α 水平，以                 组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用
          表示其分泌水平。收集各组细胞，采用实时荧光定量                            Dunnetts’t检验，检验水准α＝0.05。

          PCR 法测定其中 IL-8、TNF-α mRNA 表达水平，具体步                 3 结果
          骤为：提取各组细胞总 RNA，以超微量分光光度计检测                         3.1 芒柄花素对 LPS 诱导的 A549 细胞培养液中炎症
          RNA的浓度及纯度，随后将其反转录成cDNA。以上述                         因子的影响
          cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系包括cDNA模板                            与对照组比较，模型组细胞培养液中 IL-8、TNF-α
          1 μL（质量浓度为 20 ng/μL），SYBR qPCR Master Mix          水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，LPS+12.5
          10 μL，上、下游引物（质量浓度均为 10 μmol/L）各 0.5                组、LPS+25 组、LPS+50 组细胞培养液中 IL-8、TNF-α 水
          μL，ddH2O 8 μL。扩增条件包括：95 ℃预变性 5 min；                平均显著降低（P＜0.05）。结果见图1。


          中国药房  2023年第34卷第22期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 22    · 2723 ·
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