Page 37 - 《中国药房》2023年21期
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素钠盐溶液 0.5 mL，20 min 后麻醉并处死大鼠，取出胃                   过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗大鼠IgG二抗（稀
          组织。以10 mL的0.1 mol/L碳酸氢钠溶液冲洗胃组织，                    释度为 1∶3 000），室温孵育 1 h；以 TBST 洗涤 3 次后，在
          收集胃内容物并以 3 500 r/min 离心 15 min，收集上清                ECL溶液中避光孵育5 min。采用凝胶成像系统成像并
          液。使用酶标仪在558 nm波长处测定吸光度（A），记为                       拍照，采用 Image J 软件进行灰度值分析。以目的蛋白
          实测酚红 A。在另外的容器中加入含有 0.05% 酚红的                       与内参蛋白（GAPDH）灰度值的比值表示目的蛋白的表
          1.5%羧甲基纤维素钠盐溶液0.5 mL和0.1 mol/L碳酸氢                  达水平；其中LC3在细胞中以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ 2种形式存
          钠溶液10 mL，搅拌均匀后测定其在558 nm波长处的A，                     在，以LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值表示LC3蛋白的表达水平。
          记为标准酚红 A。计算各组大鼠的胃排空率：胃排空率                          2.10 统计学方法
         （%）＝（1－实测酚红A/标准酚红A）×100%。                               采用Graphpad prism 8.0软件对数据进行统计分析。
          2.6 大鼠小肠推进率检测                                      计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，
              在“2.3”项下取出胃组织后，各组大鼠随机取5只剪                      组间两两比较采用Tukey检验。检验水准α＝0.05。
          下幽门至回盲部的一段肠道组织，将其置于无菌的玻璃                           3 结果
          板上，不设任何牵引力，测量取下的肠管总长以及酚红                           3.1 四磨汤口服液对大鼠血清中 MTL、GAS、CCK 含
          溶液自幽门向盲肠推进的距离。计算小肠推进率：小肠                           量的影响
          推进率（%）＝酚红溶液自幽门向盲肠推进距离/肠管总                              与空白组比较，模型组大鼠血清中MTL、GAS 含量
          长×100%。                                            均显著降低（P＜0.05），CCK 含量显著升高（P＜0.05）；
          2.7 大鼠胃窦组织中ICC线粒体结构观察                              与模型组比较，阳性对照组和四磨汤组大鼠血清中
              将“2.3”项下固定 2 h 后的胃窦组织冲洗干净，再以                   MTL、GAS含量均显著升高（P＜0.05），CCK含量均显著
          1% 锇酸固定 2 h；经双蒸水冲洗后，以乙醇脱水 10 min，                  降低（P＜0.05）；四磨汤组与阳性对照组比较，上述指标
          再以环氧丙烷孵育 20 min 后，以 Spurr 树脂包埋剂进行                  差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。
          包埋。采用透射电子显微镜观察并拍照。
                                                             表1 各组大鼠血清中MTL、GAS、CCK 含量测定结果
          2.8 大鼠胃窦组织中COX ⅣⅣ、Parkin在线粒体中共定                         （x±s，n＝20，pg/mL）
          位表达的检测
                                                              组别              MTL         GAS         CCK
              采用免疫荧光共定位法进行检测。将“2.3”项下固                        空白组           238.69±14.68  259.16±18.37  176.82±17.87
          定于 4% 多聚甲醛中的胃窦组织取出，进行常规石蜡包                          模型组           82.97±6.74 a  91.68±9.32 a  246.38±25.10 a
          埋和切片（4 μm）；切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡水化                          阳性对照组         209.78±12.52 b  221.07±16.43 b  206.74±21.63 b
                                                              四磨汤组          216.37±13.93 b  232.25±15.94 b  201.92±22.51 b
          后，放入抗原修复液中，于95 ℃下水浴15 min；冷却至室温
                                                                a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05。
          后，以 0.5% 牛血清白蛋白封闭 1 h，加入 COX Ⅳ、Parkin
                                                             3.2 四磨汤口服液对大鼠胃排空率和小肠推进率的影响
          一抗（稀释度为 1∶200），4 ℃封闭过夜；加入 FITC 标记
                                                                 与空白组比较，模型组大鼠的胃排空率和小肠推进
          的山羊抗大鼠 IgG 二抗（稀释度为 1∶500），室温避光孵
                                                             率均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和
          育 1 h；以磷酸盐缓冲液清洗后，用含 DAPI 的抗荧光猝
          灭封片剂封片；10 min 后在激光共聚焦显微镜下观察                        四磨汤组大鼠的胃排空率和小肠推进率均显著升高
                                                            （P＜0.05）；四磨汤组与阳性对照组比较，上述指标差异
          COX Ⅳ、Parkin的染色情况，并利用Image J软件分析其
          共定位表达的面积。其中，COX Ⅳ抗体标记线粒体为红                         均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。
          色，Parkin抗体标记Parkin为绿色，DAPI标记细胞核为蓝                  表2 各组大鼠胃排空率和小肠推进率测定结果（x±s，
          色；若Parkin进入线粒体，则共定位显示为黄色或橙色。                            n＝5，%%）
          2.9 大鼠胃窦组织中 LC3、p62、Pink1、Parkin 蛋白表                组别                   胃排空率           小肠推进率
                                                              空白组                 58.97±3.61      84.56±6.27
          达的检测
                                                              模型组                 34.16±2.54 a    51.63±3.71 a
              采用Western blot法进行检测。将“2.3”项下冻存的                 阳性对照组               47.62±3.15 b    69.12±5.69 b
          胃窦组织取出，加入 RIPA 裂解缓冲液进行匀浆，并在                         四磨汤组                50.31±3.47 b    72.84±5.73 b
          4 ℃下以 10 000 r/min 离心 15 min，取上清液用 BCA 试              a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05。
          剂盒测定其中总蛋白浓度。将 100 μg 蛋白样品溶解在                       3.3 四磨汤口服液对大鼠胃窦组织中ICC线粒体结构
          溴酚蓝上样缓冲液中进行煮沸变性，然后每孔上样 20                          的影响
          μg 进行 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分                           空白组大鼠 ICC 形态和结构清晰，核膜完整，线粒
          离，并湿转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，              体嵴密度高。与空白组比较，模型组大鼠ICC线粒体数
          PVDF）膜上。在室温下用 5% 脱脂牛奶封闭孵育 PVDF                     量减少，线粒体空泡化，线粒体嵴模糊，并在其周围观察
          膜1 h，加入LC3、p62、Pink1、Parkin、GAPDH一抗（LC3、           到大量自噬溶酶体。与模型组比较，阳性对照组和四磨
          p62、Pink1 稀释度为 1∶1 000，Parkin 稀释度为 1∶2 000，        汤组大鼠 ICC 线粒体结构逐渐恢复，线粒体嵴清晰，自
          GAPDH稀释度为1∶2 500），4 ℃孵育过夜；洗膜后，加入                   噬溶酶体减少。结果见图1。


          中国药房  2023年第34卷第21期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 21    · 2591 ·
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