Page 36 - 《中国药房》2023年21期
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功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是最常             疫球蛋白G（IgG）二抗和过氧化物酶标记的山羊抗大鼠
          见的功能性胃肠疾病之一，以餐后饱胀、上腹部疼痛和                            IgG 二抗（批号分别为 33116、33101）均购自翌圣生物科
                                 [1]
          上腹部烧灼感为典型症状 。目前，胃动力障碍被认为                            技（上海）股份有限公司；异硫氰酸荧光素（fluorescein
          是 FD 的病理生理学特征之一，并与消化不良症状密切                          isothiocyanate，FITC）标记的山羊抗大鼠 IgG 二抗（批号
              [2]
          相关 。虽然促动力药、抗酸剂和抗抑郁药可用于治疗                            1041）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。
          FD，但其存在副作用和耐药性，因此开发新的 FD 治疗                         1.3 动物
                      [3]
          药物成为必要 。                                                本研究所用动物为 SPF 级 SD 雄性大鼠，共 90 只，6
              四磨汤口服液是根据明代《痘疹金镜录》中四磨汤                          周龄，体重 160～180 g，购自湖南斯莱克景达实验动物
          所研制的一种中药制剂，由槟榔、乌药、枳壳、木香组                            有限公司，动物生产许可证号为 SCXK（湘）2019-0004。
            [4]
          成 ，主要用于治疗消化系统疾病，其作用可能是通过调                           所有大鼠均饲养在湖南中医药大学第一附属医院中医
          节消化系统的胃肠激素和促进平滑肌收缩来促进胃肠                             内科学实验室中，动物使用许可证号为SYXK（湘）2019-
              [5]
          动力 。卡哈尔间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）        0009。饲养环境的温度为24～26 ℃，相对湿度为50%～
          是胃肠慢波活动的“起搏器”，通过传递兴奋性和抑制性                           60%。本研究经湖南中医药大学第一附属医院实验动
                                                  [6]
          信号影响胃肠运动，在肠运动中发挥重要作用 。相关                            物伦理委员会批准后实施，批准号为ZYFY20210915。
          研究发现，抑制 ICC 线粒体自噬能够改善 FD 模型大鼠                       2 方法
                                   [7]
          线粒体损伤并促进其胃动力 。PTEN 诱导假定激酶 1                         2.1 FD大鼠模型的制备
         （PTEN-induced putative kinase 1，Pink1）/E3 泛素连接酶          将大鼠适应性饲养1周后，随机选取20只大鼠作为
         （E3 ubiquitin ligase，Parkin）轴是最经典的自噬途径，              空白组，正常饲养。其余大鼠均采用不可预知的慢性应
          Pink1 和 Parkin 之间的相互作用对线粒体自噬的启动和                    激法制备FD大鼠模型 ，每日随机选取下述9种刺激之
                                                                                 [9]
                      [8]
          调节至关重要 。四磨汤口服液是否可通过影响 Pink1/                        一，且相邻2 d不重复：（1）食物剥夺（24 h）；（2）饮水剥夺
          Parkin 轴改善 FD 尚不明确。基于此，本研究建立 FD 模                   合并空瓶刺激（12 h）；（3）倒悬（30 min）；（4）束缚（30
          型大鼠，并基于线粒体自噬和 Pink1/Parkin 轴探讨四磨                    min）；（5）夹尾（1 h）；（6）明暗颠倒（24 h）；（7）湿笼饲养
          汤口服液对 FD 模型大鼠的改善作用机制，以期为临床                         （24 h）；（8）超声刺激（2 h）；（9）强迫游泳（45 ℃，5 min）。
          治疗FD提供参考。                                           连续刺激 21 d。当大鼠表现出易怒、行动缓慢、体重增
          1 材料                                                长以及排稀便等症状，表明FD模型建立成功 。
                                                                                                    [10]
          1.1 主要仪器                                            2.2 动物分组及给药处理
              Thermo型热电FC酶标仪购自上海联迈生物工程有                           将造模成功的60只大鼠随机分为模型组、阳性对照
          限公司；VHX-7000N 型透射电子显微镜购自日本 Key‐                     组、四磨汤组，每组 20 只。阳性对照组大鼠灌胃 3.5
                                                                                 [11]
          ence公司；STELLARIS 5型激光共聚焦显微镜购自德国                     mg/kg 多潘立酮片溶液 ，四磨汤组大鼠灌胃 5.4 mL/kg
          Leica 公司；iBright FL1500 型凝胶成像系统购自美国                 四磨汤口服液（为临床等效剂量），空白组和模型组大鼠
          Thermo Fisher Scientific公司。                         均灌胃等体积生理盐水，每天1次，持续14 d。
          1.2 主要药品与试剂                                         2.3 样本采集
              四磨汤口服液（国药准字 Z20025044，批号 221026，                    末次给药结束后，用 1% 戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻
          每1 mL相当于饮片0.15 g）购自湖南汉森制药股份有限                       醉大鼠，然后腹主动脉采血 3 mL 于离心管中，放置 2 h
          公司；多潘立酮片（批号220809，规格10 mg）购自西安杨                     后在 4 ℃下以 3 000 r/min 离心 15 min，收集上清液保存
          森制药有限公司；胃动素（motilin，MTL）、胃泌素（gastrin，               于－20 ℃冰箱中备用。每组随机选取 15 只大鼠，断颈
          GAS）、胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）酶联免疫吸                处死后对大鼠进行剃毛消毒，无菌条件下解剖并分离胃
          附 测 定（ELISA）检 测 试 剂 盒（批 号 分 别 为 R38269、             窦组织，然后每组随机挑取5个组织立即置于2.5%戊二
          R38270、R37102）均购自上海酶研生物科技有限公司；                      醛中固定 2 h，另每组取 5 个组织置于 4% 多聚甲醛中固
          兔源微管相关蛋白轻链 3（microtubule-associated protein         定，剩余组织均冻存于－80 ℃冰箱中。
          light chain 3，LC3）、p62 单克隆抗体和甘油醛-3-磷酸脱              2.4 大鼠血清中胃肠激素的含量检测
          氢酶（GAPDH）多克隆抗体及鼠源细胞色素C氧化酶Ⅳ                              取出“2.3”项下保存的血清，置于冰上溶解，然后按
         （cytochrome C oxidase Ⅳ，COX Ⅳ）、Pink1、Parkin 单克       试剂盒说明书方法操作，检测大鼠血清中胃肠激素
          隆 抗 体（批 号 分 别 为 ab128025、ab207305、ab9485、           MTL、GAS和CCK的含量。
          ab33985、ab186303、ab77924）均购自英国 Abcam 公司；            2.5 大鼠胃排空率检测
          BCA 蛋白定量试剂盒（批号 12L026）购自和元李记（上                          采用酚红含量法进行检测。将每组剩余的5只大鼠
          海）生物技术有限公司；过氧化物酶标记的山羊抗兔免                            禁食18 h，然后灌胃含有0.05%酚红的1.5%羧甲基纤维


          · 2590 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 21                            中国药房  2023年第34卷第21期
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