Page 42 - 《中国药房》2023年19期
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              胃癌是全球第五大常见癌症 ，全球每年约有 100                        ab32572）购自英国Abcam公司；山羊抗小鼠免疫球蛋白
          万人诊断为胃癌，其中约40%的新发病例和死亡病例发                           G二抗（批号223120412）购自北京中杉金桥生物技术有
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          生在中国 。目前，胃癌的主要治疗方法包括手术和放                            限公司。
          化疗，但术后复发率高，并且晚期胃癌患者化疗后5年生                           1.3 实验动物
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          存率低于 5% 。中医药作为我国医疗事业中不可或缺                               本研究所用动物为 SPF 级裸鼠，雄性，4 周龄，实验
          的一部分，不仅能提高化疗药的疗效、减少副作用、提高                           动物生产许可证号为SCXK（苏）2021-0010，动物合格证
          患者生活质量，还能减慢肿瘤生长速度、缓解临床症状，                           号为202235128。本研究经广西中医药大学动物伦理委
          在肿瘤患者治疗中的应用也日益广泛。                                   员会审核批准，批准号为DW20220621-122。
              清热化湿方为经典方“藿朴夏苓汤”加黄连、栀子化                         1.4 细胞株
          裁而成。藿朴夏苓汤出自清代的《医原》，能宣通气机、                               人胃腺癌 AGS 细胞购自赛百慷（上海）生物技术股
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          燥湿利水 。本课题组前期研究证实，清热化湿方能够                            份有限公司。
          防治幽门螺杆菌感染相关的胃癌              [5―6] 。近年来miRNA与        2 方法
          胃癌的关系被广泛报道。本课题组前期通过基因芯片                             2.1 清热化湿方药液的制备
          分析发现，胃癌组织中的 miRNA-155 会被明显下调 ，                          按处方量称取清热化湿方药材，捣碎，先以8倍量水
                                                        [7]
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          且稳定沉默 miRNA-155 可促进胃癌的进展 。此外，有                      煮沸30 min，用8层纱布过滤；药渣再以6倍量水煮沸30
          研究显示，miRNA能够通过调节Wnt/β-catenin信号通路                   min 后同法过滤；合并两次滤液，浓缩成质量浓度为 1
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          参与调控胃癌细胞的生物学行为 。基于此，本研究通                            g/mL的药液（以生药量计），于4 ℃条件下保存备用。
          过构建胃癌荷瘤裸鼠模型探讨清热化湿方是否能够通                             2.2 miRNA-155过表达AGS细胞株的构建
          过 干 预 miRNA-155 抑 制 Wnt/β -catenin 信 号 通 路 中            将AGS细胞铺板于培养皿中，密度为5×10 个/皿；
                                                                                                       4
          Wnt7、β-catenin、T 细胞因子 4（T-cell factor-4，TCF-4）表     待细胞汇合度为 80% 时，以最佳感染复数（200）进行病
          达进而治疗胃癌，以期为清热化湿方的临床应用提供                             毒感染；继续培养24 h后更换为DMEM高糖培养基；感
          依据。                                                 染 72 h 后，加入含 5 µg/mL 嘌呤霉素的完全培养基进行
          1 材料                                                筛选，以后每天用荧光显微镜观察细胞荧光及细胞状
          1.1 主要仪器                                            态，当荧光效率在 90% 以上时表明 miRNA-155 过表达
              IX71 型荧光倒置显微镜购自日本 Olympus 公司；                   AGS细胞株构建成功。
          RM2135 型切片机购自德国 Leica 公司；3K15 型低温冷                  2.3 胃癌荷瘤模型裸鼠的构建及分组给药
          冻离心机购自德国 Sigma 公司；Mini Protean 3 Cell 型电                将裸鼠适应性喂养 1 周后按体重随机分为模型组、
          泳仪购自美国BioRad公司；MK3型酶标仪、ChemiScope                   对照组、过表达组和清热化湿方低、中、高剂量组，每组5
          5300 Pro 型一体式化学发光成像仪均购自美国 Thermo                    只。将裸鼠置于超净台内，以75%乙醇消毒裸鼠右侧腋
          Fisher Scientific公司。                                部皮肤后，除过表达组裸鼠接种过表达 miRNA-155
          1.2 药品与试剂                                           AGS细胞外，其余各组裸鼠接种AGS细胞悬液（密度为
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              清热化湿方（包括藿香6 g、白豆蔻1.8 g、淡豆豉9 g、                  1×10 个/mL）。清热化湿方低、中、高剂量组裸鼠从造
          川厚朴 3 g、姜半夏 4.5 g、杏仁 9 g、赤茯苓 9 g、猪苓 4.5             模第 2 天起分别按 2.71、5.43、10.86 g/kg 灌胃相应药液
          g、泽泻4.5 g、生薏苡仁12 g、黄连12 g、栀子12 g）购自广               （剂量参考文献[10]设置），对照组腹腔注射顺铂（0.004
          西中医药大学附属瑞康医院。过表达 miRNA-155 慢病                       g/kg）+氟尿嘧啶（0.02 g/kg）（剂量根据临床等效剂量换
          毒由汉恒生物科技（上海）有限公司构建；DMEM高糖培                          算），每天1次，连续3周；模型组和过表达组灌胃等体积
          养基、胎牛血清（批号分别为 SH30022.01、SH30406.05）                生理盐水。末次给药后禁食不禁水，于24 h后采用颈椎
          均购自美国 HyClone 公司；青链双抗（批号 E607011）购                  脱臼法处死，并取肿瘤组织进行检测分析。
          自生工生物工程（上海）股份有限公司；嘌呤霉素、Trizol                       2.4 裸鼠肿瘤抑制率的测定
          RNA 提取试剂、SYBRGreen PCR 试剂盒、逆转录试剂盒                       以生理盐水冲洗各组裸鼠肿瘤组织，然后测量其质
         （批号分别为A1113803、15596026、F-415XL、K1622）均购             量，并计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率＝（模型组肿瘤组
          自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；0.25% 胰蛋白酶          织质量－干预组肿瘤组织质量）/模型组肿瘤组织质量×
         （批号C0201）购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA                         100%。
          蛋白定量试剂盒（批号BL521A）购自广州硕谱生物科技                         2.5 裸鼠肿瘤组织的病理学形态观察
          有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS，批号 422300）购自北京                          取各组裸鼠部分肿瘤组织，以 10% 甲醛固定液固
          索莱宝科技有限公司；ECL发光液购自美国Millipore公                      定，切开病灶，流水冲洗干净后放入生物脱水机中逐级
          司；兔源 Wnt 单克隆抗体（批号 10605-1-AP）购自美国                   脱水、透明、石蜡浸泡、包埋，切片 4 μm，以常规苏木素-
          Proteintech 公 司 ；兔 源 β -catenin 单 克 隆 抗 体（批 号       伊红（HE）染色后，采用显微镜观察并拍照。


          · 2340 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 19                            中国药房  2023年第34卷第19期
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