Page 72 - 《中国药房》2023年16期

（r＝0.999 1），检测质量浓度的线性范围分别为0.001 25～ 果显示，各样品实测质量浓度的平均值与标示值的偏差
0.125 μg/mL、0.037 5～3.75 ng/mL，定 量 下 限 分 别 为 均在±15% 内，符合“生物样品定量分析方法验证指导
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0.001 25 μg/mL、0.037 5 ng/mL。 原则”的要求 。
2.5.3 精密度与准确度试验 2.6 临床应用
取健康受试者空白血浆 40 μL，按“2.5.2”项下方法 本研究共纳入患者 10 例。纳入标准包括：（1）年龄
制备拉考沙胺、吡仑帕奈的定量下限、低、中、高质量浓 18～60岁；（2）临床确诊癫痫；（3）服用过拉考沙胺和/或
度（拉考沙胺：0.001 25、0.003 75、0.025、0.093 75 μg/mL； 吡仑帕奈；（4）连续规律服用抗癫痫药并达稳态。排除
吡仑帕奈：0.037 5、0.112 5、0.75、2.812 5 ng/mL，下同）的 标准包括：（1）采血困难者；（2）研究人员认为其他原因
质控血浆样品，按“2.4”项下方法处理（每质量浓度平行 所致的不适合临床试验者。本研究方案通过华中科技
6份），再按“2.1”“2.2”项下条件，连续3 d完成3次检测， 大学同济医学院附属同济医院医学伦理委员会审核批
考察批内、批间精密度（以变异系数表示）和准确度（以 准（伦理批件号TJ-IRB20220833），所有患者均签署知情

标示值为参照）。结果显示，定量下限和低、中、高质量 同意书。
浓度质控血浆样品的批内、批间变异系数为1.0%～6.9% 10 例癫痫患者口服拉考沙胺片或吡仑帕奈片恒定
（n＝6或n＝3），准确度均值为标示值的87.3%～110.9% 剂量超过1个月（已达稳态），于服药前30 min采集静脉
（n＝6 或 n＝3），符合“生物样品定量分析方法验证指导 血1～2 mL，按“2.4”项下方法处理后，再按“2.1”“2.2”项
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原则”的要求 。 下条件进样分析，记录峰面积并代入随行标准曲线计算
2.5.4 提取回收率与基质效应试验 其血浆样品中拉考沙胺或吡仑帕奈的质量浓度，再通过
取“2.3”项下低、中、高质量浓度的质控溶液，按 样品处理过程中的稀释倍数换算得谷浓度。结果（表2）
“2.5.2”项下方法制备低、中、高质量浓度的质控血浆样 显示，1～5 号患者体内拉考沙胺的谷浓度为 5.3～12.2
品（每质量浓度平行 6 份），按“2.4”项下方法处理，再按 μg/mL，6～10 号患者体内吡仑帕奈的谷浓度为 208～
“2.1”“2.2”项下条件进样分析，记录各待测成分与内标 510 ng/mL。
的峰面积比值（A1 ）。取6份不同来源的健康受试者空白
表2 癫痫患者基本情况及药物谷浓度测定结果
血浆，按“2.4”项下方法处理（不加内标）后，取上清液，加
患者编号 性别 年龄/岁 治疗药物 给药方案 谷浓度
入低、中、高质量浓度的质控溶液和内标工作液，使最终
1 男 56 拉考沙胺 50 mg，每天2次 7.3 μg/mL
质量浓度与低、中、高质量浓度质控血浆样品对应（每质 2 男 24 拉考沙胺 50 mg，每天2次 6.8 μg/mL
量浓度平行6份），按“2.1”“2.2”项下条件进样分析，记录 3 男 35 拉考沙胺 100 mg，每天2次 12.2 μg/mL
4 女 34 拉考沙胺 100 mg，每天2次 10.4 μg/mL
各待测成分与内标的峰面积比值（A2 ）。取乙腈740 μL，
5 女 28 拉考沙胺 50 mg，每天2次 5.3 μg/mL
加入低、中、高质量浓度质控溶液 40 μL 和内标工作液 6 男 19 吡仑帕奈 12 mg，每天1次 414 ng/mL
20 μL，涡旋后取 50 μL，用乙腈-水（20∶80，V/V）950 μL 7 男 45 吡仑帕奈 8 mg，每天1次 285 ng/mL
稀释（每质量浓度平行6份），按“2.1”“2.2”项下条件进样 8 男 50 吡仑帕奈 4 mg，每天1次 257 ng/mL
9 女 43 吡仑帕奈 6 mg，每天1次 208 ng/mL
分析，记录各待测成分与内标的峰面积比值（A3 ）。A1/A2
10 女 21 吡仑帕奈 8 mg，每天1次 510 ng/mL
为提取回收率，A2/A3为内标归一化的基质效应。结果显
示，拉考沙胺、吡仑帕奈的平均提取回收率分别为 3 讨论
99.7%～100.9%、98.6%～99.8%（RSD 均 小 于 3%，n＝ 本研究的样品前处理选择了简单、快速的蛋白沉淀
6），其内标归一化的基质效应分别为 96.4%～99.5%、 法，与甲醇相比，使用乙腈作为蛋白沉淀剂能够获得更
95.7%～99.0%（RSD 均小于 3%，n＝6），符合“生物样品 好的色谱峰峰形。在内标的选择上，笔者前期比较了几
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定量分析方法验证指导原则”的要求 。 种常用的内标物质，由于氯氮平价廉易得，且保留时间
2.5.5 稳定性试验 与吡仑帕奈、拉考沙胺接近，故最终选择了氯氮平作为
取“2.3”项下单一对照品储备液，考察其－80 ℃下 内标。在色谱柱的选择上，笔者前期比较了 Welch Ulti‐
放置 90 d 的稳定性；取“2.3”项下低、高质量浓度的质控 mate XB-C18 （50 mm×2.1 mm，5.0 μm）、Welch Xtimate
溶液，按“2.5.2”项下方法制备低、高质量浓度的质控血 C18（50 mm×2.1 mm，5.0 μm）和 Phenomenex Synergi
浆样品（每质量浓度平行3份），考察其处理前常温放置 Fusion-RP（50 mm×2.0 mm，4.0 μm）等市售 C18色谱柱
4 h、4 ℃下放置24 h、冻融（－80 ℃～室温）3次、－80 ℃ 的分离效果，结果显示，以 Welch Ultimate XB-C18 （50
下放置 30 d 和处理后进样器中放置 24 h 的稳定性。结 mm×2.1 mm，5.0 μm）为色谱柱时，待测成分的色谱峰

· 1982 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 16 中国药房 2023年第34卷第16期