Page 61 - 《中国药房》2023年16期
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μmol/L、噻氯匹定10 μmol/L、奎尼丁10 μmol/L、酮康唑                      表3 PCR引物/探针序列和产物长度
          10 μmol/L） 或空白对照（0.1 mmol/L 磷酸盐缓冲液）；                基因                 引物/探针序列               产物长度/bp
                   [12]
                                                              CYP1A2  正向引物（5′→3′）：CCTCCTTCTTGCCCTTCACC   23
          其 余 为 0.1  mol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液（pH7.4，含 氯 化 镁 5
                                                                    反向引物（5′→3′）：GGATGTAGAAGCCATTCAGCG
          mmol/L）。待复方曲肽注射液或阳性抑制剂在人肝微粒                               探针（5′FAM→3′TAMRA）：CCCCCACAGCACAACAAGGGACA
          体 中 预 孵 育 15  min 后 ，加 入 各 亚 酶 的 探 针 底 物 和          CYP2B6  正向引物（5′→3′）：ACTCTCCGCTACGGCTTCC    19
          NADPH，于37 ℃下孵育30 min。每组配制3个平行样。                           反向引物（5′→3′）：ATGGCATTTTGGCTCGGTC
                                                                    探针（5′FAM→3′TAMRA）：ATGCTCAAATACCCTCATGTTGCAGAGAGAGT
          各组加入含 20 ng/mL 氧氟沙星（内标）的冰甲醇终止反
                                                              CYP3A4  正向引物（5′→3′）：TGCAGGAGGAAATTGATGCA   20
          应，涡旋 3 min 后，以 13 500 r/min 离心 10 min，取上清                 反向引物（5′→3′）：GTCAAGATACTCCATCTGTAGCA
          液，按“2.1”项下条件以内标法测定各探针底物代谢产物                               探针（5′FAM→3′TAMRA）：TTTTACCCAATAAGGCACCACCCACCTATG
         （对乙酰氨基酚、羟基安非他酮、N-去乙基阿莫地喹、4-                          β-actin  正向引物（5′→3′）：CCTGGCACCCAGCACAAT    18
                                                                    反向引物（5′→3′）：GCCGATCCACACGGAGTACT
          羟基双氯芬酸、4-羟基美芬妥英、去甲右美沙芬、6β-羟基                              探针（5′FAM→3′TAMRA）：TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC
          睾酮）的生成量，并计算各CYP450酶亚型的剩余酶活性
         （剩余酶活性＝复方曲肽注射液组或阳性对照组代谢产                            大鼠尾静脉注射复方曲肽注射液0.9 mL/kg（以临床常用
          物生成量/空白对照组代谢产物生成量×100%）；同时，                        剂量换算得大鼠等效剂量），每天 1 次，连续 10 d；第 10
          采用GraphPad 8软件进行非线性拟合，并计算半数抑制                      天尾静脉注射30 min后，两组大鼠均灌胃含7个探针底
          浓度（IC50 ）。                                         物的混合溶液（茶碱8 mg/kg、安非他酮2 mg/kg、瑞格列
          2.3 复方曲肽注射液对人原代肝细胞 CYP450 酶的体                      奈 1 mg/kg、甲苯磺丁脲 1 mg/kg、奥美拉唑 10 mg/kg、美
          外诱导实验                                              托洛尔10 mg/kg、咪达唑仑8 mg/kg，各探针底物的浓度
              待人原代肝细胞复苏后，用贴壁培养液稀释得                           由预实验确定）。
                6
          0.7×10 个/mL 的活细胞悬液，再以每孔 100 μL 接种至                     分别在灌胃探针药液前（0 min）以及给药后 5、10、
          预铺Ⅰ型胶原的96孔板中，于37 ℃、5%CO2条件下预孵                      20、30、45 min 和 1、2、4、6、9、12、24 h 于眼内眦取血 0.5
          育过夜，待贴壁单层细胞形成后，以肝细胞培养液继续                           mL，置于含肝素钠的抗凝离心管中，以 3 000 r/min离心
          培养。第2天，每孔加入含不同浓度复方曲肽注射液（该                          10 min，分离血浆；血浆样品经3倍体积的甲醇沉淀蛋白
          药占细胞孵育体系总体积的 0.05%、0.25%、0.5%、1%、                  后取上清液（部分样品进样前需稀释），按“2.1”项下条件
                  [10]
          5%、10%） 或阳性诱导剂（奥美拉唑50 μmol/L、苯巴比                   以内标法测定各时间点探针底物的含量，并应用 Phoe‐
          妥1 000 μmol/L、利福平25 μmol/L）或阴性对照药（罗红               nix WinNonlin 8.1药动学软件计算各探针底物的药动学
                        [13]
          霉素 10 μmol/L） 的培养液，并设置不含受试药物、阳                     参数并绘制药-时曲线。
          性诱导剂、阴性对照药的空白培养液作为空白对照。每                           2.5 统计学方法
          组配制 3 个平行样。连续培养 2 d 后，弃去培养液，收                          采用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析，采用
          集细胞并提取其总 RNA，经消化后反转录合成 cDNA，                       GraphPad Prism 8.4.3软件作图。计量资料以x±s表示，
          并以此为模板进行扩增。反应体系包括 cDNA 模板                          药动学参数比较采用独立样本t检验（方差齐）或t’检验
         （最终含量为 200 ng）、正/反向引物（最终浓度均为 300                   （方差不齐）。检验水准α＝0.05。
          nmol/L）、荧光探针（最终浓度为 200 nmol/L）、2×Super‐            3 结果
          Real PreMix（Probe）、50×ROX 参比染料。反应条件为               3.1 复方曲肽注射液对CYP450酶的体外抑制作用
          95 ℃预变性 15 min；95 ℃变性 3 s，60 ℃退火延伸 30 s，               阳性抑制剂处理后的各CYP450酶亚型的剩余酶活
          循环40次。采集荧光信号，以β-actin为内参，以空白对                      性均低于 50%，各探针底物代谢受到明显抑制，说明孵

          照 组 为 参 照 ，采 用 2   －ΔΔCt  法 计 算 CYP1A2、CYP2B6、     育体系合格（具体结果略）。复方曲肽注射液对人肝微
          CYP3A4 mRNA 的相对表达量（即诱导倍数）。PCR 引                    粒体中 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、
          物/探针序列和产物长度见表3。                                    CYP2D6、CYP3A4 酶的抑制曲线见图 1。由图 1 可见，
          2.4 复方曲肽注射液对大鼠 CYP450 酶影响的体内                       经不同浓度的复方曲肽注射液（0.05%～10%）处理后，
          实验                                                 CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19 酶的活性无明显变化，未
              取SD大鼠12只，随机分为对照组和实验组，每组6                       能 拟 合 出 IC50；而 CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、
          只。对照组大鼠尾静脉注射生理盐水0.9 mL/kg，实验组                      CYP3A4 的活性均有所下降，且有一定的浓度依赖趋


          中国药房  2023年第34卷第16期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 16    · 1975 ·
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