Page 63 - 《中国药房》2023年15期
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2.2.2 MH7A细胞活力的检测                                  2.2.5 MH7A细胞侵袭能力的检测
              采用 CCK-8 法进行检测。取对数生长期的 MH7A                        采用 Transwell 侵袭法进行检测。Transwell 上室预
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          细胞，以5×10 个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100                     先涂基质胶备用，取对数生长期的MH7A细胞用无血清
          μL。待细胞贴壁后，分别加入10 μL不同浓度的β-谷甾                       培养基调整密度为 2×10 个/mL 并接种于上室中，每孔
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          醇[终浓度为0（空白组）、5、10、20、40 μmol/L，参照相关                100 μL，下室加入 600 μL 完全培养基。按“2.2.3”项下
              [9]
          文献 实验方法进行调整]。24 h 后每孔加入 10 μL                      EdU 法分组、给药。24 h 后，取出上室，去除培养基，用
          CCK-8 溶液孵育 4 h，采用酶标仪于 450 nm 波长处测定                 棉签轻轻擦拭基质胶和上室内未侵袭的细胞。取新的
          每孔的吸光度值，计算细胞活力以筛选β-谷甾醇最适给                          24 孔板，加入 600 μL 4% 多聚甲醛，放入上室固定 30
          药浓度。                                               min，弃固定液，用 0.1% 结晶紫染色 10 min，PBS 清洗风
          2.2.3 MH7A细胞增殖能力的检测                                干后置显微镜下观察计数。
              采用 CCK-8 法进行检测。取对数生长期的 MH7A                    2.2.6 MH7A细胞上清液中IL-1β、IL-6水平的检测
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          细胞，以2×10 个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100                         采用 ELISA 法进行检测。取对数生长期的 MH7A
          μL培养过夜，弃去培养液。将细胞分为对照组（细胞不                          细胞以 3×10 个/mL 接种于 24 孔板，每孔 1 mL，待细胞
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          做任何处理）、模型组（10 ng/mL TNF-α 诱导，剂量设置                  贴壁后，按“2.2.3”项下EdU法分组、给药。24 h后，收集
          参考文献[10]）、β-谷甾醇组（10 ng/mL TNF-α+β-谷甾               各组细胞的培养上清液，按相关试剂盒操作说明书进行
          醇，β-谷甾醇的剂量设置参考“2.2.2”项下所得结果），同
                                                             操作，检测IL-1β、IL-6水平。
          时设置空白组（不加细胞和药物，只加培养基），每组设3
                                                             2.2.7 MH7A细胞中PPARα mRNA表达水平的检测
          个复孔。对照组加入新鲜培养基，模型组和β-谷甾醇组
                                                                 采用 qRT-PCR 法进行检测。取对数生长期 MH7A
          先加入含10 ng/mL TNF-α的培养基孵育细胞12 h，β-谷
                                                             细胞以1×10 个/mL接种于6孔板，每孔2 mL，待细胞贴
                                                                        5
          甾醇组再加入β-谷甾醇进行处理。给药处理24 h后，每
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          孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h，酶标仪测定每孔450
                                                             胞，采用 Trizol 法提取各组细胞总 RNA，使用逆转录试
          nm波长处的光密度值（optical density，OD）值，计算细胞
                                                             剂盒合成 cDNA 后以其为模板进行 RT-PCR。以 β-actin
          活力。细胞活力（%）＝（实验组 OD450－空白组 OD450 ）/
                                                             为内参，用2     －△△Ct 法计算PPARα的相对表达量。PPARα
         （对照组OD450－空白组OD450 ）×100%，实验组即模型组
                                                             上游引物为 5′-GATGCGCTGACAGATGGAGA-3′，下
          和β-谷甾醇组。
                                                             游引物为 5′-TAGAGACGGCTCTTCTGCCT-3′；β-actin
              采用 5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EdU）法进行检
                                                             上游引物为5′-GCCAACACAGTGCTGTCTGG-3′，下游
          测。取对数生长期的 MH7A 细胞，以 2×10 个/mL 的密
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                                                             引物为5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′。
          度接种于 96 孔板中，每孔 100 μL 培养过夜。细胞分为
                                                             2.2.8 MH7A细胞中PPARα蛋白表达水平的检测
          对照组、模型组、β-谷甾醇组，各组同CCK-8法相应组进
                                                                 采用 Western blot 法进行检测。按“2.2.7”项下方法
          行处理。24 h后每孔加入50 μmol/L的EdU溶液100 μL
                                                             接种细胞，按“2.2.3”项下 EdU 法分组、给药。24 h 后收
          孵育 2 h 后弃培养基，PBS 清洗 2 次。加入 4% 多聚甲醛
                                                             集细胞，向细胞沉淀中加入 RIPA 裂解液（含 1% 蛋白酶
          50 μL 于室温孵育 30 min，再加入 2 mg/mL 的甘氨酸 50
                                                             抑制剂）在冰上裂解 30 min，低温离心取上清液。用
          μL于摇床孵育5 min并清洗。加入100 μL 0.5%曲拉通
          X-100 于摇床孵育 10 min 后废弃，加入 Apollo 染色液               BCA试剂盒对各组蛋白进行定量分析，取等量蛋白质变
          100 μL，避光、室温、摇床孵育 30 min 后，加入 100 μL               性后行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至 PVDF 膜，加 5%
          0.5% 曲 拉 通 X-100 清 洗 2～3 次 。 最 后 加 入 100  μL       脱脂奶粉于室温封闭 1 h，随后加入不同一抗[PPARα
          Hoechst 33342 染色液，避光、室温、摇床孵育 30 min，              （2 μg/mL）、β-actin（稀释比为 1∶1 000）]于 4 ℃孵育过
          PBS清洗后于荧光显微镜下观察并拍照，统计发生增殖                          夜，TBST清洗后加入HRP标记的羊抗鼠IgG（稀释比为
          的细胞数目。                                             1∶2 000）室温孵育1 h，洗涤后加入ECL发光液显影，用
          2.2.4 MH7A细胞迁移能力的检测                                Image J 软件分析灰度值。以 β-actin 作为内参，计算
              采用划痕实验进行检测。取对数生长期的 MH7A                        PPARα的相对表达量。
          细胞以 2×10 个/mL 接种于 6 孔板，每孔 2 mL。待细胞                 2.3 PPARα敲低后β-谷甾醇对MH7A细胞增殖、迁移、
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          融合至80%及以上，用10 μL枪头垂直划线后用PBS清                       侵袭、炎症因子分泌及PPARα蛋白表达的影响
                                                                                               4
          洗 3 次，加入 2 mL 无血清培养基，显微镜下拍照记录为                         取对数生长期 MH7A 细胞以 5×10 个/孔接种于 24
          0 h的划痕状态。按“2.2.3”项下EdU法分组、给药。24 h                  孔板中，当细胞汇合至 40% 时进行转染。将细胞分为
          后在显微镜下拍照，使用 Image J 软件统计划痕面积并                      β-谷甾醇组（细胞不转染，用10 ng/mL TNF-α+β-谷甾醇
          计算细胞迁移率。细胞迁移率（%）＝（0 h 划痕面积－                        处理，剂量设置同“2.2.3”项下分组设置，下同）、siNC 组
          24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。                           （细胞转染 siNC 并用 10 ng/mL TNF-α+β-谷甾醇处理）、


          中国药房  2023年第34卷第15期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 15    · 1849 ·
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