Page 56 - 《中国药房》2023年15期
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水肿情况；于术后第14天使用眼前节超声成像系统测量                          “2.2.1”项下方法分组、给药、培养，每组设 6 个复孔。于
          其角膜厚度；于术后第1天起，每天使用手持眼压仪测量                           培养72 h时，将细胞与含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂
          其眼内压。上述检查均在麻醉后进行。                                   混合物的 T-PER 试剂充分混合，冰浴 15 min 后离心，吸
          2.1.4 兔角膜内皮结构观察及功能相关蛋白表达检测                          取上清液。以BCA法测定蛋白浓度后使蛋白变性。取
              于术后第 14 天，以心内注射过量戊巴比妥钠（85                       变性蛋白样品适量，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并
          mg/kg）处死各组兔，立即取下其角膜组织并保存于含                          转移至聚偏二氟乙烯膜上，用 5% 脱脂奶粉封闭 1 h，加
          Opti-MEM培养液50 mL的试管中。取各组兔一部分角                       入 RhoA、BMPR1A、BMPR2、GAPDH 一抗（稀释比例均
          膜组织，内皮面朝上放置，以1%茜素红染液染色3 min，                        为 1∶1 000），4 ℃孵育过夜；洗膜后，加入 HRP 标记的
          使用相差显微镜观察角膜内皮结构。另取 BAK 组和                           IgG 二抗（稀释比例为 1∶5 000），室温孵育 1 h；洗膜后，
          BAK+SF组兔剩余角膜内皮组织，采用免疫荧光染色法                          以化学发光试剂显色，使用化学发光成像仪成像并使用
          检测鬼笔环肽、ZO-1、钠钾 ATP 酶、Ki67 蛋白的表达情                    Quantity One 软件分析蛋白条带的灰度值，以目的蛋白
          况：角膜内皮组织以－10 ℃预冷的甲醇固定后，在室温                          与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值作为目的蛋白的表
          下用 1% 胎牛血清白蛋白封闭 1 h，随后加入鬼笔环肽、                       达水平。
          ZO-1、钠钾 ATP 酶、Ki67 一抗（稀释比例分别为 1∶500、                2.3 统计学方法
          1∶400、1∶500、1∶1 000），孵育60 min；洗涤后，在避光、室                 采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。数据以
          温条件下加入 FITC 标记的 IgG 二抗（稀释比例为 1∶                     x±s表示，组间比较采用方差分析和事后Duncan’s多重
          200），孵育45 min；洗涤后，用1.5 mg/mL的DAPI染液复
                                                              检验。检验水准α＝0.05。
          染10 min。使用荧光显微镜于激发波长450～520 nm下                     3 结果
          捕获图像，并使用Image J 1.48软件检测荧光强度，用以
                                                              3.1 体内实验结果
          表示鬼笔环肽、ZO-1、钠钾 ATP 酶、Ki67 蛋白的表达
                                                              3.1.1 SF对兔角膜状态的影响
          情况。
                                                                  实验期间，对照组兔的角膜基质未出现浑浊及水
          2.2 体外实验
                                                              肿，眼内压正常，角膜状态良好（图略）。BAK 组兔的角
          2.2.1 原代兔CEC培养、分组与给药
                                                              膜透明度逐渐降低，基质水肿程度逐渐加重，角膜厚度
              术后第 14 天，取 BAK 组兔的角膜、巩膜组织，置于
                                                              逐渐增加（P＜0.05），提示大泡性角膜病变模型制备成
          Optisol 液中于 4 ℃下保存。剥取角膜内皮并用胶原酶
                                                              功。与BAK组比较，BAK+SF组兔的角膜透明度和基质
          消化，离心收集兔 CEC 聚集物，以兔 CEC 培养液（含
                                                              水肿情况均有所好转（图1A、图1B），且角膜厚度显著减
          10% 胎牛血清、10 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、25
                                                              小（P＜0.05，表 1）；3 组兔的眼内压基本维持在 10～20
          μg/mL 庆大霉素、1.25 μg/mL 两性霉素 B 的 Opti-MEM
                                                              mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）的正常范围内，组间比较差
          培养液）重悬并接种至涂有FNC的24孔板中，在37 ℃、
                                                              异均无统计学意义（P＞0.05，图1C）。
          5%CO2条件下培养。待原代兔CEC贴壁24 h后，将细胞
                                                              3.1.2 SF 对兔角膜内皮结构及功能相关蛋白表达的
          分为空白组和SF组，SF组兔CEC用不同质量浓度的SF
                                                              影响
          溶液（25、50、100、200、400、800 mg/L，质量浓度参考
                 [3]
          Jiang 等 研究设置）处理，空白组仅加入等体积的兔                             茜素红染色实验结果显示，BAK 组兔角膜内皮缺
                                                              失，CEC 已缺损至 C 区并表现出不规则的细胞形态；相
          CEC培养液。
          2.2.2 兔CEC活力检测                                      反，BAK+SF组兔CEC仅缺损至B区并表现为正常的六
              采用 MTT 法进行检测。取对数生长期的原代兔                         边形内皮细胞结构（图2A）。免疫荧光染色实验结果显
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          CEC，以每孔 1×10 个接种至 96 孔细胞板中，按“2.2.1”                 示，与 BAK 组比较，BAK+SF 组兔角膜内皮组织中鬼笔
          项下方法分组、给药、培养，每组设6个复孔。于培养48                          环肽、ZO-1、钠钾 ATP 酶、Ki67 蛋白的表达均显著升高
          h 时，加入 MTT 试剂 37 μL 孵育 4 h；加入二甲基亚砜                 （P＜0.05，图2B、图2C）。
          100 μL，使用多功能酶标仪于590 nm波长下检测各孔的                      3.2 体外实验结果
          光密度（optical density，OD）值，用以表示细胞活力。细胞                3.2.1 SF对兔CEC活力的影响
          以同法接种并分为空白组和不同质量浓度SF组（50、100、                           培养 48 h 且当 SF 质量浓度≤200 mg/L 时，SF 对兔
          200 mg/L），每组设6个复孔。分别于培养12、24、48、72、                 CEC 的增殖有一定的促进作用，SF 200 mg/L 组细胞的
          96 h时，同法检测各孔的OD值，用以表示细胞活力。                          OD值显著高于空白组（P＜0.05，图3A）。进一步实验结
          2.2.3  兔 CEC 中 RhoA、BMPR1A、BMPR2 蛋 白 表 达            果显示，与空白组比较，SF 200 mg/L组细胞的OD值（培
          检测                                                  养 48、72、96 h 时）和 SF 100 mg/L 组细胞的 OD 值（培养
              采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的原                  72、96 h时）均显著升高，且具有浓度依赖性（P＜0.05）和
                               4
          代兔 CEC，以每孔 1×10 个接种至 96 孔细胞板中，按                     时间依赖趋势（图3B）。

          · 1842 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 15                            中国药房  2023年第34卷第15期
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