Page 36 - 《中国药房》2023年15期
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[2]
          有重要的意义 。近年来，中医药在肿瘤治疗中越来越                            1.3 细胞株
          受到重视，其在提高肿瘤患者生活质量、预防转移复发、                               本研究所用肺癌NCI-H226细胞购自中国科学院生

          防治多药耐药、减毒增效方面发挥了重要作用，充分体                            物化学与细胞生物学研究所。
          现了中医药在肿瘤治疗中的优势 。                                    2 方法
                                      [3]
              中医学者认为肺癌之标实以热毒为甚，热毒当为肿                          2.1 NCI-H226细胞培养
          瘤发生、发展的重要原因之一，故清热解毒之法治疗肺                                取出冻存的NCI-H226细胞进行复苏后，加入F-12K
                      [4]
          癌当行之有效 。连翘为木犀科植物连翘Forsythia sus‐                    培养基（含10%胎牛血清、1%青-链霉素）中，置于37 ℃、
          pensa（Thunb.） Vahl 的干燥果实，为传统常用清热解毒                  5% CO2条件下培养，取对数生长期的 NCI-H226 细胞用
          药。相关文献报道，连翘醇提物具有广谱抗肿瘤活性，                            于实验。
                    [5]
                                [6]
          对肾癌细胞 、食管癌细胞 等多种癌细胞具有明显的抑                           2.2 NCI-H226细胞增殖率的检测
          制作用。核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号               取对数生长期细胞调整密度至 2×10 个/mL，再接
                                                                                                  5
          通路是一条与癌细胞发生、发展相关的经典通路 ，可调                           种至96孔板中，然后分为对照组，连翘醇提物低、中、高
                                                   [7]
                         [9]
                  [8]
          控食管癌 、肺癌 、胰腺癌 等多种肿瘤细胞的恶性生                           浓度组（5、10、20 mg/mL，质量浓度根据前期预实验结果
                                 [10]
                             [11]
          物学进程。朱帅旗等 的研究也论述了靶向 NF-κB 疗                         设置），激活剂组（10 mg/mL 连翘醇提物+0.5 μmol/L
          法能够抑制非小细胞肺癌的生长和转移，并增强抗肿瘤                            NF-κB 信号通路激活剂 PMA ），抑制剂组（10 mg/mL
                                                                                       [12]
          免疫应答。基于此，本研究以肺癌 NCI-H226 细胞为研                       连翘醇提物+10 μmol/L NF-κB信号通路抑制剂BAY 11-
          究对象，并基于NF-κB信号通路探讨连翘醇提物对该细                          7082 ），阳性对照组（20 μg/mL 顺铂 ）。除对照组细
                                                                  [13]
                                                                                              [14]
          胞增殖、迁移和侵袭的影响，以期为连翘醇提物治疗肺                            胞不作干预外，其余各组细胞加入相应药物，置于
          癌提供实验数据支撑。                                          37 ℃、5% CO2条件下培养 24 h，每组设 3 个复孔。根据
          1 材料                                                EdU细胞增殖检测试剂盒说明书方法处理，采用荧光显
          1.1 主要仪器                                            微镜拍照，再用Image J软件处理图片，以阳性染色细胞
              MCO18AIC 型二氧化碳培养箱购自日本 Sanyo 公                  （红色）占总细胞（蓝色）的百分比表示细胞增殖率。
          司；MF52-N 型倒置荧光显微镜购自广州市明美光电技                         2.3 NCI-H226细胞迁移能力的检测
                                                                                                  5
          术有限公司；IMARK 型酶标仪、Chemi Doc 型凝胶成像                        取对数生长期细胞调整密度至 2×10 个/mL，再接
          系统购自美国Bio Rad公司。                                    种至 6 孔板中，按“2.2”项下方法分组后，置于 37 ℃、5%
          1.2 主要药品与试剂                                         CO2条件下培养；当细胞密度达90%时，用枪头于孔板底

              连翘醇提物（批号 20190203，质量浓度为 1 mg/L）                 部进行划痕，然后加入相应药物培养24 h，每组设3个复
          购自天津美伦医药集团有限公司；顺铂、NF-κB 信号                          孔。采用显微镜拍照记录各组细胞 0、24 h 时的划痕情
          通路抑制剂BAY 11-7082（纯度均大于98%，批号分别为                     况，并记录这两个时间点时的融合面积，分别记为 S0与
          N03GS166211、J07HS173399）购自上海源叶生物科技有                 S24，再计算细胞迁移率，细胞迁移率（%）＝（S0－S24 ）/S0×
          限公司；NF-κB信号通路激活剂PMA（纯度≥98%，批号                       100%。
          0000112801）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；                       2.4 NCI-H226细胞侵袭能力的检测
          胎牛血清（批号2176404）购自美国Gibco公司；F-12K培                       采用 Transwell 小室法进行检测。取对数生长期细
          养基、RIPA裂解液、CCK-8试剂盒购自武汉默沙克生物                        胞按“2.2”项下方法分组、给药、培养后，以胰酶消化，离
          科技有限公司；5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EdU）细胞                       心后用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至3×10                      5
          增殖检测试剂盒（批号 042621211123）购自上海碧云天                     个/mL。将装有上述细胞的24孔板放入Transwell小室，
          生物技术有限公司；鼠抗人 NF-κB 抑制蛋白 α（NF-κB                     上室加入无血清培养基200 μL，下室加入含10%血清的

          inhibitor protein alpha，IκBα）、NF-κB p65、磷酸化 IκBα    培养基 500 μL，每组设 3 个复孔。培养 24 h 后弃上清
         （p-IκBα）、磷酸化 NF-κB p65（p-NF-κB p65）、β-actin（一        液，擦去上室细胞，以4%甲醇固定下室细胞，以0.1%结
          抗）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG（二抗）（批号                         晶紫染色 10 min，清洗 3 次，将 Transwell 小室置于显微
          分 别 为 10021317、10021394、10021301、10021309、          镜下，每孔随机选5个不同区域，采用显微镜观察拍照，
          10021787、20000374）购自美国CST公司。                        并以Image J软件计算侵袭细胞数。


          · 1822 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 15                            中国药房  2023年第34卷第15期
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