Page 21 - 《中国药房》2023年14期

表7 Box-Behnken响应面实验设计与结果 2.2.4 验证实验
序号 A（药材粉碎度）/目 C（乙醇体积分数）/% D（浸渍时间）/h Y 按最优工艺平行提取3次，测定提取液中补骨脂素、
1 20 67.5 24 78.70 异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂异黄酮、补骨脂
2 60 67.5 24 87.08
3 20 67.5 72 78.52 定、补骨脂乙素、补骨脂酚的浓度，计算 Y 值。结果显
4 60 67.5 72 88.39 示，Y 的平均值为 98.27，RSD＝1.36%（n＝3），与拟合方
5 20 40 48 20.65 程预测值97.28的相对误差为1.02%，表明该模型的预测
6 60 40 48 23.85 性较好，优选的工艺稳定可行。
7 20 95 48 61.18
8 60 95 48 88.96 2.3 补骨脂提取液治疗白癜风的药效考察
9 40 40 24 27.02 2.3.1 补骨脂提取液的制备
10 40 40 72 26.40 按最优工艺提取补骨脂饮片的有效成分，将提取液
11 40 95 24 75.19
12 40 95 72 76.79 于 60 ℃水浴中浓缩至干，并用超纯水复溶得到补骨
13 40 67.5 48 78.58 脂原液，随后用 E3 培养液将之稀释至 250、500、1 000、
14 40 67.5 48 78.82 2 000、5 000 μg/mL系列质量浓度（以生药量计）。
15 40 67.5 48 82.94
16 40 67.5 48 80.43 2.3.2 药物质量浓度的确定
17 40 67.5 48 78.73 显微镜下选取 1 dpf 后正常发育的 AB 系斑马鱼胚
胎，将 50 枚胚胎随机转移到含有 200 µmol/L 1-苯基-2-
应用 Design-Expert 12.0.3 软件对数据进行回归分
硫脲培养液的 6 孔板中，2 dpf 后用蛋白酶（1.5 mg/mL，
析和显著性检验。以Y值为响应值，拟合的二次多项式
持续10 min）去除绒毛膜并更换为含不同质量浓度补骨
方程为Y＝－138.085 6－0.542 0A－0.573 7D+6.069 6C+
脂提取液的培养液，并以E3培养液作为空白对照，在胚
2
0.000 8AD+0.011 2AC+0.000 8CD+0.000 7A +0.005 2D － 胎发育到5 dpf时观察并记录其死亡情况，其间每隔24 h
2
2
0.041 7C（R ＝0.995 9，校正 R ＝0.990 7）。方差分析结 换一次培养液并将死亡胚胎及时移除。如图2所示，补
2
2
果见表8。 骨脂提取液质量浓度为 5 000 μg/mL 时，斑马鱼胚胎的
死亡率为 100%；质量浓度≤2 000 μg/mL 时，大部分斑
表8 Box-Behnken响应面实验方差分析结果
马鱼胚胎发育正常，死亡率≤8%。因此本研究最终选
来源 离差平方和 自由度 F P
模型 9 869.21 9 190.35 ＜0.000 1 择500、1 000、2 000 μg/mL作为实验药物质量浓度。
A 302.950 1 52.590 0.000 2 100
C 5 212.21 1 904.77 ＜0.000 1
D 0.556 50 1 0.096 6 0.765 0
80
AC 151.040 1 26.220 0.001 4
AD 0.555 00 1 0.096 3 0.765 3 60
CD 1.230 00 1 0.213 9 0.657 8 胚胎死亡率/%
A 2 0.357 20 1 0.062 0 0.810 5 40
C 2 4 186.19 1 726.67 ＜0.000 1
D 2 37.420 0 1 6.500 0 0.038 2
20
残差 40.330 0 7
失拟项 26.530 0 3 2.560 0 0.192 7
0
纯误差 13.800 0 4
总离差 9 909.53 16 0 250 500 1 000 2 000 5 000
补骨脂提取液的质量浓度/（μg/mL）
注：检验水准α＝0.05。 图2 补骨脂提取液对斑马鱼胚胎死亡率的影响
由表8可知，模型显著且失拟项无显著性，表明该模 2.3.3 补骨脂提取液对斑马鱼黑色素生成的影响
型拟合度较好，可用于预测补骨脂最优提取工艺参数；A 按照“2.3.2”项下方法进行实验，实验分为空白对照
[8]
和C对Y值的影响显著，D对Y值的影响无显著性；各交 组、阳性对照组（8-甲氧基补骨脂素，10.8 μg/mL ）和补
2
2
互项中的AC、C 、D 对Y值的影响均显著，其他交互项对 骨脂提取液低、中、高浓度组（500、1 000、2 000 μg/mL），
每组6条。在5 dpf时使用立体显微镜采集斑马鱼图像，
Y值的影响均无显著性，表明存在交互作用。
用Image J软件对采集图像进行密度测定。数据以x±s
对回归模型进行优化分析得到补骨脂有效成分提
表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较
取的最优工艺为：药材粉碎度 59.816 目，乙醇体积分数
采用 Dunnett 检验，检验水准 α＝0.05。结果显示，与空
80.491%，浸渍时间71.974 h。但考虑到实际操作的便利 白对照组比较，补骨脂提取液低、中、高浓度组斑马鱼黑
性和可行性，将最优工艺调整为：药材粉碎度60目，乙醇 色素沉着分别增加了 1.41、1.45、2.06 倍，黑色素沉着比
体积分数80%，浸渍时间72 h。 例均显著增加（P＜0.01），结果见图3。

中国药房 2023年第34卷第14期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 14 · 1679 ·