Page 62 - 《中国药房》2023年13期
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置于玻璃微量反应瓶中，室温下氮气吹干。加入 15
          分分析。色谱条件：采用Agilent ZORBAX RRHDSB-C18
         （100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱，以 0.05% 甲酸溶                mg/mL的甲氧胺吡啶溶液80 μL，37 ℃孵育90 min。加
          液（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～4 min，                       入BSTFA 80 μL，70 ℃下孵育60 min，冷却至室温后，即
          95%A→90%A；4～10 min，90%A→88%A；10～11 min，             可进样。

          88%A；11～16 min，88%A→75%A；16～30 min，75%A→            2.6.2 气相色谱-质谱分析条件
          5%A；30～33 min，5%A→95%A）；流速为 0.3 mL/min；               采用气相色谱-质谱联用仪对经前处理的血清样本
          柱温为30 ℃，进样量为1 μL。质谱条件：采用Dual AJS                    进行数据采集，血清代谢组学气相色谱-质谱分析条件
          电喷雾离子源（ESI），在正、负离子模式下检测；干燥气                         见参考文献[11]。
          温度为 320 ℃，流速为 8 mL/min；雾化器压力为 35 psi；               2.6.3 数据处理与分析
          鞘气温度为 350 ℃，流速为 11 mL/min；毛细管电压为                      采用Agilent Masshunter Qualititative Analysis B.07.00
          4 000 V；喷嘴电压为 1 000 V；碰撞能量为 10 eV；扫描                和NIST 14.0化学数据库对采集所得的质谱数据进行定
          范围为质荷比（m/z）50～1 200 ；离子源温度为150 ℃。                   性分析，再将定性数据结果导入SIMCA-P 14.1软件进行
          2.3 分组、造模与给药                                        主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏
              将22只小鼠适应性喂养1周后，按照体质量分为对                         最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-
          照组（n＝6）、造模组（n＝16）。对照组小鼠给予普通饲                        discriminant analysis，OPLS-DA）和置换检验分析。根据
          料，自由饮水（纯水）；造模组小鼠给予高脂饲料，自由饮                          变 量 重 要 性 投 影（variable  importance  in  projection，
                                                                                             [12]
          水（浓度为12.5%的果葡糖浆），建立小鼠高胆固醇血症                         VIP）＞1且P＜0.05筛选差异化合物 ，然后结合人类代
              [9]
          模型 。造模10周后，眼眶取血，制备血清，测定血清中                          谢组数据库（HMDB，https：//hmdb.ca）确证差异代谢物，
          TC水平，若对照组和造模组小鼠血清中TC水平差异有                           并将差异代谢物导入 HMDB 数据库进行化学分类及所
                                           [9]
          统计学意义（P＜0.05），表示造模成功 。造模成功后，                        处细胞位置分类。利用 MetaboAnalyst 5.0 数据库对已
          造模组小鼠根据血清TC水平、体质量均衡随机分组，进                           鉴定的差异代谢物进行通路富集分析，以 P＜0.05 作为
          一步分成模型组（n＝8）和大蓟提取物组（n＝8）。大蓟                         筛选条件得到相关的信号通路。
          提取物组小鼠灌胃 400 mg/（kg·d）大蓟提取物（给药剂                     2.7 统计学、作图与制表方法
          量参考文献[10]，并结合课题组前期相关研究设定，以提                             采用 SPSS 20.0、Graphpad Prism 8.0 软件进行数据
          取物计），对照组和模型组小鼠同时给予等体积0.3%羧                          统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因
          甲基纤维素钠溶液。所有小鼠每日上午同一时间灌胃                             素方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。检验水
          给药1次，连续给药6周。                                        准 α＝0.05。使用 Graphpad Prism 8.0、Adobe Illustrator
          2.4 样本采集与处理                                         2022软件作图，使用Excel 2019软件制表。
              末次给药后，小鼠禁食 12 h，采用乙醚麻醉小鼠后                       3 结果
          眼眶取血。血液在室温静置 2 h 后，以 3 500 r/min 离心                 3.1 大蓟提取物的成分分析结果
          10 min，取上清液，于－80 ℃冰箱中保存。将小鼠处死，                          本研究共鉴定出大蓟提取物的12种成分（见表1）。
          快速分离肝脏组织，取小块肝左外叶置于包埋盒中，在                            由结果可知，大蓟提取物中主要是酚酸类和黄酮类成
          4%多聚甲醛中固定24～48 h用于后续实验。                             分，如绿原酸、蒙花苷和柳穿鱼叶苷等。
          2.5 血清生化指标测定及肝脏组织病理分析                                         表1 大蓟提取物成分鉴定结果
              取“2.4”项下血清，按照对应试剂盒方法测定血清中                       序号   保留  分子量 准分子离子峰（m/z） 主要碎片离子（m/z）     鉴定化合物
          TC、TG 水平。取“2.4”项下肝脏组织，常规制备石蜡切                           时间/min
                                                               1   3.073  154  153.046 8[M-H] －  137.017 9、109.024 5  原儿茶酸 [13]
          片（厚度4 μm）后进行苏木素-伊红染色，中性树胶封片，                         2   3.526  354  353.074 1[M-H] －  191.047 2、179.026 7、135.038 8  绿原酸 [14]
          最后在显微镜下观察小鼠肝脏组织病理变化。                                 3   3.532  354  353.077 1[M-H] －  191.047 0  新绿原酸 [14]
                                                               4   3.559  354  353.076 0[M-H] －  191.047 5、179.026 5、173.037 5、161.016 9、隐绿原酸 [15]
          2.6 血清代谢组学研究                                                              135.038 8
          2.6.1 血清样本前处理                                        5   6.003  286  287.175 5[M+H] +  259.139 9、230.115 6  木犀草素 [16]
                                                               6  12.359  593  593.185 2[M+H] +  447.126 9、285.074 2  蒙花苷 [16]
            血清代谢组学研究的样本前处理方法参考文献[11]。
                                                               7  12.878  623  623.201 0[M+H] +  477.138 1、315.086 1  柳穿鱼叶苷 [16]
          取小鼠血清 20 μL，精密加入质量浓度为 1 mg/mL 的十                     8  14.612  314  315.087 0[M+H] +  300.061 4、285.074 2  柳穿鱼黄素 [16]
          九烷酸甲醇溶液10 μL，再加入水-甲醇-氯仿溶液（2∶5∶2，                     9  16.346  270  271.058 3[M+H] +  235.166 5、211.131 3  芹菜素 [17]
                                                              10  17.288  300  301.068 6[M+H] +  286.045 4、258.050 2  香叶木素 [16]
          V/V/V）250 μL，涡旋混匀后在4 ℃下孵育20 min，然后再                 11  18.428  180  181.120 8[M+H] +  163.110 3、135.115 5、107.084 1、91.053 0 咖啡酸 [15]
          在室温下以14 000 r/min离心15 min，取上清液200 μL，               12  19.496  284  285.074 2[M+H] +  270.050 6、242.055 9  金合欢素 [16]


          · 1592 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 13                            中国药房  2023年第34卷第13期
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