Page 44 - 《中国药房》2023年9期
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COPD模型；对照组大鼠置于烟熏箱但不进行烟熏处理，                          2.8 大鼠肺组织中 RIPK1/RIPK3/MLKL 信号通路相
          并在造模大鼠注射 LPS 的相同时间点通过气管注射等                          关mRNA表达检测
          体积的生理盐水。造模 24 h 后开始给药，Wog 低、高剂                          采用实时荧光定量（qRT）-PCR 法检测。取“2.4”项
          量组和氨茶碱组大鼠在灌胃对应剂量药物的同时还需                             下肺组织，制备组织匀浆，采用Trizol试剂提取组织中总
          尾静脉注射等体积的生理盐水；rRIPK1组大鼠在尾静脉                         RNA，并检测其纯度。将总 RNA 逆转录为 cDNA 后，以
          注射对应剂量药物的同时还需灌胃等体积的生理盐水；                            cDNA 为模板进行 qRT-PCR 反应。反应体系包括：正、
          Wog高剂量+rRIPK1组大鼠在灌胃对应剂量药物的同时                        反 向 引 物 各 0.5  µL，2×SYBR  Premix  Ex Taq  10  µL，
          还需尾静脉注射相应的药物；对照组、模型组大鼠需灌                            cDNA 模板 1 µL，用 dd H2O 补至总体积为 20 µL。反应
          胃及尾静脉注射等体积的生理盐水。各组大鼠每天给                             程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火
          药1次，持续4周。                                           30 s，72 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参，
          2.3 大鼠肺功能检测                                         采用 2 －ΔΔCt 法计算 RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 的表达
              末次给药24 h后，利用生物信号采集系统呼吸传感                        水平。引物序列由广州基迪奥生物科技有限公司合成，
                                                              引物序列及扩增产物长度见表1。
          器测定各组大鼠的吸气峰流量（peak inspiratory flow，
                                                                    表1 qRT-PCR引物序列及扩增产物长度
          PIF）、呼气峰流量（peak expiratory flow，PEF）、每分钟通
                                                              基因名称  正向引物（5′-3′）      反向引物（5′-3′）      扩增产物长度/bp
          气量（minute ventilation，MV）和第 1 秒用力呼气容积
                                                              GAPDH  GTGGACCTGACCTGCCGTCT  GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT    86
         （forced expiratory volume in one second，FEV1 ）/用力肺   RIPK1  AGGTACAGGAGTTTGGTATGGGC  GGTGGTGCCAAGGAGATGTATG  122
          活量（forced vital capacity，FVC）比值的变化。                 RIPK3  TAGTTTATGAAATGCTGGACCGC  GCCAAGGTGTCAGATGATGTCC  106
                                                              MLKL  GCCACTGGAAAGATCCCGTT  CAACAACTCGGGGCAATCCT    98
          2.4 标本收集
                                                              2.9 大鼠肺组织中 RIPK1/RIPK3/MLKL 信号通路相
              肺功能检测后，大鼠腹主动脉取血，离心（3 000
                                                              关蛋白表达检测
          r/min，10 min）收集血清，用于 ELISA 检测；血清收集结
                                                                  采用 Western blot 法检测。取“2.4”项下肺组织，用
          束后，用2%戊巴比妥钠麻醉并处死大鼠，收集大鼠的肺
                                                              RIPA 裂解缓冲液裂解并提取肺组织匀浆中的总蛋白，
          组织并分为两部分，每部分包含6只大鼠的肺组织。将
                                                              利用二喹啉甲酸法测定总蛋白浓度，将总蛋白在 95 ℃
          一部分肺组织固定于4%多聚甲醛中，用于苏木精-伊红
                                                              下变性 5 min 后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶
         （HE）和 TUNEL 染色；另一部分冻存于－80 ℃冰箱中，
                                                              电泳（分离胶电压 80 V，电泳时间 40 min；浓缩胶电压
          用于相应mRNA和蛋白表达检测。
                                                              120 V，电泳时间 1 h）分离后，再在 300 mA 电流的作用
          2.5 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平检测
                                                              下，转膜1 h至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂牛奶
              取“2.4”项下血清，严格按照 ELISA 试剂盒说明书
                                                              封闭 1.5 h 后，与一抗 RIPK1（稀释比例 1∶2 000）、RIPK3
          方法操作，检测大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。
                                                             （稀释比例 1∶1 000）、p-MLKL（稀释比例 1∶3 000）、
          2.6 大鼠肺组织病理形态学变化观察
                                                              MLKL（稀释比例1∶2 000）、GAPDH（稀释比例1∶3 000）
              采用 HE 染色法检测。将固定于 4% 多聚甲醛中的                      在 4 ℃下孵育过夜；洗膜后，再将膜与二抗（稀释比例
          肺组织包埋在石蜡中，常规制备5 µm厚的石蜡切片，再                          1∶3 000）在室温下孵育1 h。使用ECL试剂使蛋白质条
          常规行HE染色后进行组织学分析。所有切片均使用光                            带可视化。利用 Image J 1.8.0 软件分析蛋白条带灰度
          学显微镜以200倍的放大倍数成像。                                   值，以 RIPK1、RIPK3 蛋白与内参蛋白（GAPDH）条带灰
          2.7 大鼠肺组织中肺上皮细胞凋亡检测                                 度值的比值表示 RIPK1、RIPK3 蛋白的表达水平，以 p-
              采用TUNEL染色法检测。将“2.6”项下石蜡切片脱                      MLKL 蛋白条带与 MLKL 蛋白条带灰度值的比值表示
          蜡至水合，依次用 3% 过氧化氢和蛋白酶 K 液体（20                        p-MLKL蛋白的表达水平。
          mg/mL）处理，随后在 37 ℃下用 TUNEL 试剂处理 60                   2.10 统计学方法
          min。然后将切片用100 μL 3，3′-二氨基联苯胺在25 ℃                       使用SPSS 19.0软件进行统计分析。符合正态分布
          下染色 10 min，并用苏木精复染。在光学显微镜下以                         的数据以 x ˉ± s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，
          200 倍放大倍数鉴定和计数每个切片中的 TUNEL 阳性                       进一步组间比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          凋亡细胞。TUNEL阳性凋亡细胞的细胞核呈棕色或棕                           3 结果
          褐色，而正常细胞的细胞核呈蓝色。计算细胞凋亡率，                            3.1 Wog对大鼠肺功能的影响
          细胞凋亡率（%）＝TUNEL阳性凋亡细胞数/总细胞数×                             与对照组比较，模型组大鼠 PIF、PEF、MV、FEV1/
          100%。                                               FVC比值显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，Wog低、


          · 1062 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 9                              中国药房  2023年第34卷第9期
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