Page 67 - 《中国药房》2023年8期
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          模型组（IL-6 50 ng/mL ）、给药组（IL-6 50 ng/mL+熊果           2.5 熊果酸对 IL-6 刺激后 231 细胞中 JAK2/STAT3 信
          酸 20 µmol/L，熊果酸给药浓度参考“2.1”项下结果设                    号通路与EMT相关标志物的蛋白表达影响的检测
          置），每组设置 3 个复孔。对照组用完全培养基培养 24                           同“2.2”项下方法进行细胞分组（每组设置 3 个复
          h，给药组与模型组用相应浓度的IL-6刺激24 h，之后给                      孔）及干预，于给药组给药 48 h 后收集各组细胞，采用
          药组用含相应浓度药物的完全培养基培养48 h。用200                        Western blot 法检测 JAK2/STAT3 通路中 JAK2、p-JAK2、
          µL 枪头在 6 孔板内垂直划“一”字后，用 D-hanks 液清洗                 STAT3、p-STAT3 4 种蛋白及 EMT 相关标志物 E-cad、
          漂落的细胞。3 组细胞分别于给药组给药后 0 h 与 12 h                    MMP2、MMP9、Vim、CD44、ALDH1A1 蛋白的表达水
          在同一位置拍照记录，采用 Image J 软件分析划痕面积                      平。在细胞中加入RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制剂的
          并计算细胞迁移率，细胞迁移率（%）＝（0 h 划痕面积－                       蛋白裂解液）后冰上裂解 30 min，离心后保留上清液，
          12 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。                            采用 BCA 法进行蛋白浓度测定，将蛋白浓度调整到
          2.3 熊果酸对IL-6刺激后231细胞侵袭影响的检测                        1 µg/µL 后进行高温变性。取 10 µL 变性蛋白样品进行
              采用 Transwell 实验检测熊果酸对 231 细胞侵袭能                十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，起始浓缩胶电
          力的影响。提前将基质胶于 4 ℃解冻，枪头预冷，基质                         压调至80 V，待样本基本平齐后电压转至120 V，溴酚蓝
          胶与无血清培养基以 1∶8 混合均匀后取 100 µL 加入小                    抵达凝胶底部时停止电泳。将胶上蛋白转移到 PVDF
          室，于孵育箱中放置 4 h。将细胞悬液用无血清培养基                         膜，5%牛血清白蛋白封闭2 h，加入相对应的一抗，稀释
          调整至 5×10 个/mL，分别取 100 µL 细胞悬液加入小室                  比例均为 1∶1 000，4 ℃孵育过夜；次日用 TBST 洗涤后
                     5
          内，小室外加入 500 µL 血清浓度为 15% 的培养基，细胞                   加入山羊抗兔/鼠二抗（稀释比例均为1∶5 000）室温孵育
          分组及给药参考“2.2”项下，每组设置3个复孔。给药组                        2 h，TBST洗涤3次后于化学发光成像系统上成像显影。
          给药后各组细胞于37 ℃继续孵育48 h，采用4%多聚甲
                                                             用 Image J 软件分析图像灰度值，以目的蛋白与内参蛋
          醛固定 15 min，1% 结晶紫染色 15 min，磷酸盐缓冲液清
                                                             白（GAPDH）的灰度值比值作为前者的相对表达量，以
          洗小室，用棉签拭去小室内的细胞，充分晾干后在显微
                                                             p-JAK2 与 JAK2 灰度值的比值、p-STAT3 与 STAT3 灰度
          镜下随机选择5个视野，采用Image J软件分析穿膜细胞
                                                             值的比值反映JAK2、STAT3的磷酸化水平。
          数量并计算细胞侵袭率，细胞侵袭率（%）＝模型组或给
                                                             2.6 统计学方法
          药组穿膜细胞数/对照组穿膜细胞数×100%。
                                                                 采用SPSS 25.0软件进行统计分析，计量资料以x±s
          2.4 熊果酸对IL-6刺激后231细胞中EMT相关标志物
                                                             表示，多组资料比较采用单因素方差分析，两两间比较
          mRNA表达影响的检测
                                                             采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
              同“2.2”项下方法进行细胞分组（每组设置 3 个复                     3 结果
          孔）及干预，于给药组给药 48 h 后收集各组细胞，采用
                                                             3.1 熊果酸对231细胞增殖率的影响
          TRIZOL-氯仿法提取 RNA，采用 q-PCR 法检测细胞中
                                                                 随着药物浓度的升高，231细胞增殖率均逐渐降低，
          EMT 相 关 标 志 物 E-cad、MMP2、MMP9、Vim、CD44、
                                                             呈现剂量依赖趋势。熊果酸在20～40 µmol/L时，231细
          ALDH1A1 mRNA 的表达水平。PCR 扩增程序（反应体
                                                             胞的增殖率在85%以上，对细胞的增殖能力无明显的抑
          系为20 µL）为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，62 ℃
                                                             制作用，结果见图1。本实验选取低浓度20 µmol/L作为
          退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环。以GAPDH为内
                                                             后续实验中熊果酸的给药浓度。
          参，以对照组为参照，计算 2            －ΔΔCt  值确定各目的基因
          mRNA的相对表达量。各引物序列见表1。                                   150
                         表1 基因引物序列                               100
          基因名称    引物序列（5′-3′）             引物长度/bp  产物长度/bp      细胞增殖率/％
          GAPDH   正向引物：TCTGACTTCAACAGCGACACC  21     119         50
                  反向引物：CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT  23
          CD44    正向引物：CAGCAACCCTACTGATGATGACG  23   110
                  反向引物：GCCAAGAGGGATGCCAAGATGA  23                 0
          MMP2    正向引物：TACAGGATCATTGGCTACACACC  23   156               正常组     20 μmol/L   40 μmol/L   80 μmol/L   160 μmol/L   320 mol/L
                  反向引物：GGTCACATCGCTCCAGACT  19                                         熊果酸浓度
          Vim     正向引物：CGGGAGAAATTGCAGGAGGA  20      340     图1 不同浓度熊果酸对231细胞增殖率的影响（n＝6）
                  反向引物：AAGGTCAAGACGTGCCAGAG  20
          E-cad   正向引物：GACAACAAGCCCGAATT    17       156     3.2 熊果酸对IL-6刺激后231细胞迁移的影响
                  反向引物：GGAAACTCTCTCGGTCCA   18                   与对照组细胞迁移率[（100.00±8.70）%]比较，模型
          ALDH1A1  正向引物：AGGGCCAGTGTTGTATAGCC  20     92      组细胞迁移率[（142.40±18.12）%]显著升高（P＜0.05）；
                  反向引物：TCCACATTCCAGTTTGGCCC  20
          MMP9    正向引物：GGGACGCAGACATCGTCATC  20      117     与模型组比较，给药组细胞迁移率[（104.98±14.06）%]
                  反向引物：TCGTCATCGTCGAAATGGGC  20              显著降低（P＜0.05），结果见图2。


          中国药房  2023年第34卷第8期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 8    · 957 ·
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