Page 24 - 《中国药房》2023年7期
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氨基胍组（100 mg/kg）以及 FPS-ZM1 组（1 mg/kg），上述             和睾丸组织中AGEs水平。
                                                    [10]
          各组给药剂量根据本课题组前期研究结果设置 。另                             2.7 小鼠睾丸组织中RAGE蛋白和凋亡相关蛋白Bax、
          外将同期饲养的 C57BL/6J 小鼠作为正常组，每组 6 只。                    Bcl-2表达水平的检测
          梓醇组和氨基胍组小鼠灌胃相应药物，正常组和模型组                                采用 Western blot 法进行检测。各组分别取 3 只小
          小鼠灌胃等量生理盐水，FPS-ZM1组小鼠以1 mL/g腹腔                      鼠的睾丸组织适量，以 1∶9 的比例（g/mL）加入含有 1%
          注射相应药物，连续8周。                                        蛋白酶抑制剂和 1% 磷酸酶抑制剂的 RIPA 进行匀浆裂
          2.2 小鼠一般体征、睾丸脏器系数、精子活力的检测                           解，离心收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白
              末次给药后，检测各组小鼠的体质量、空腹血糖以                          经变性后，取50 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝
          及 24 h 摄食量、饮水量和尿量。实验结束后，取小鼠睾                        胶电泳，转膜，用 5% 脱脂奶粉封闭 2 h，加入 RAGE、
          丸称定质量并计算睾丸脏器系数（睾丸脏器系数＝睾丸                            Bax、Bcl-2、β-actin 一抗（稀释度为 1∶1 000），4 ℃过夜；
          质量/体质量）。取一侧睾丸组织剪成组织块（另侧组织                           次日以PBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗室温孵育
          置于冰箱中保存备用），置于培养皿中，加 1 mL 生理盐                        2 h；PBST 洗膜 3 次，每次 10 min，洗膜后显影；利用
          水，置于 37 °C、5% CO2条件下培养 30 min，使精子自行                 Image J软件分析目的蛋白的灰度值，以目的蛋白与内参
          散开，通过血球计数板统计精子总数。吸取部分小鼠精                            β-actin的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
          子悬液滴在载玻片上，置于显微镜下观察并记录5个固                            2.8 小鼠睾丸组织中糖酵解关键限速酶相应mRNA表
          定视野中精子数量，并计算精子活力[精子活力＝（前向                           达水平的检测
          运动精子数+非前向运动精子数）/精子总数×100%]。                             采用实时定量 PCR 法进行检测。各组分别取 3 只
          2.3 小鼠睾丸组织病理形态学和超微结构的观察                             小鼠的睾丸组织适量，采用 Trizol 法提取总 RNA，再根
              取各组小鼠睾丸组织适量，置于 4% 的多聚甲醛溶                        据逆转录试剂盒说明书方法操作，逆转录为 cDNA。以
          液中，经常规脱水、石蜡包埋、切片后，取部分切片（剩余                          cDNA为模板进行PCR，以β-actin为内参，根据2             －△△Ct 法
          部分进行免疫组化染色）进行HE病理形态学染色，中性                           计算目的基因的表达水平，每个样本重复3次。本研究
          树胶封片，采用显微镜观察，并根据生精细胞排列、结构                           所用己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（phos‐
          坏死病变、间质增生和炎症细胞增生情况进行睾丸病理                            phofructose kinase，PFK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，
                             [11]
          形态学病变程度评分 。另取部分睾丸组织切成小块                             PK）、LDH的引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司设
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         （1 mm），置于 2.5% 戊二醛固定液中固定 24 h，以 50%、                 计合成。引物序列及扩增产物长度见表1。
          70%、80%、90%、100%丙酮梯度脱水，经环氧树脂包埋、                             表1 PCR引物序列及扩增产物长度
          切片后，用醋酸铀和枸橼酸铅进行双染色，然后采用透                            基因          引物序列（5′→3′）               扩增产物长度/bp
          射电镜观察小鼠睾丸组织的超微结构。                                   β-actin     上游：GCGTGACATCAAAGAGAAGC      188
                                                                          下游：AGGATTCCATACCCAAGAAGG
          2.4 小鼠睾丸组织中GSH、SOD和LDH水平的检测
                                                              HK          上游：CCGAGCTGAAGGATGACCAA      200
              取各组小鼠睾丸组织适量，加入9倍量（g/mL）生理                                   下游：CCCCTTTTCTGAGCCGTCC
          盐水进行匀浆，于4 ℃条件下以2 500 r/min离心10 min；                 PK          上游：AGTCCTGGATGGAGCAGACT      136
          取上清液，按照试剂盒说明书方法操作，测定睾丸组织                                        下游：TTCAAACAGCAGACGGTGGA
                                                              PFK         上游：CTGCCCTGAATGTGATTGTCG     195
          中GSH、SOD和LDH水平。                                                 下游：CGTTGGACTGCAAATCTCCG
          2.5 小鼠睾丸组织中糖代谢产物及通路分析                               LDH         上游：GGTGGACAGGGAATGTACGG      118
              采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法进行分                                   下游：GAGCGACCTCATCGTCCTTC
            [12]
          析 。取各组小鼠睾丸组织适量，称质量，并在液氮                             2.9 统计学方法
          中研磨；每个样品加入 1 mL 预冷的甲醇-乙腈-水溶液                            采用 SPSS22.0 软件进行统计分析。数据以 x±s 表
         （2∶2∶1，V/V/V）和等体积的内标琥珀酸盐和丙氨酸，置                       示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采
          于－20 ℃条件下孵育1 h，于4 ℃条件下以14 000 r/min                 用LSD-t检验，检验水准α＝0.05。
          离心20 min，取上清液进行LC-MS/MS分析。采用Mul‐                    3 结果
          tiQuant软件提取色谱峰峰面积和保留时间，采用能量代                        3.1 梓醇对 KK-Ay 自发性糖尿病小鼠一般体征、睾丸
          谢物标准品进行校准，并对代谢物进行鉴定，使用                              脏器系数及精子活力的影响
          MetaboAnalyst 数 据 库（https：//www. metaboanalyst. ca/）    与正常组比较，模型组小鼠24 h摄食量、饮水量、尿
          定位差异代谢物影响的关键糖代谢通路。                                  量和空腹血糖均显著升高（P＜0.01），体质量、睾丸脏器
          2.6 小鼠血清和睾丸组织中AGEs水平的检测                             系数、精子活力、精子总数均显著降低或减少（P＜
              采用 ELISA 法进行检测。各组分别取 4 只小鼠的                     0.01）。与模型组比较，各给药组小鼠上述指标（FPS-
          血清和睾丸组织匀浆液适量，稀释10倍后，根据试剂盒                           ZM1 组 24 h 饮水量除外）均显著逆转（P＜0.05 或 P＜
          说明书方法操作，采用酶标仪于450 nm波长处测定血清                         0.01）。结果见表2。


          · 786 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 7                               中国药房  2023年第34卷第7期
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