Page 28 - 《中国药房》2023年6期

2.2 细胞存活率检测 3 结果
采用MTT法进行检测。取处于对数生长期的PC12 3.1 ST-11对OGD/R损伤的PC12细胞存活率的影响
细胞，按“2.1”项下方法接种、分组、给药、造模。复糖复 与空白组比较，模型组细胞的存活率显著降低（P＜
氧 4 h 后，每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 试剂 20 μL，孵育 4 0.05）；与模型组比较，各药物组细胞的存活率均显著升
h，吸弃上清液，加入二甲基亚砜100 μL，混匀，使用酶标 高（P＜0.05）。结果见表1。

仪在 490 nm 波长处检测各孔的光密度（optical density， 表1 ST-11 对 OGD/R 损伤的 PC12 细胞存活率及细胞
OD）值并计算细胞存活率：细胞存活率（%）＝实验组 上清液中LDH、CAT、GSH、MDA、SOD含量的影
响（x±s，n＝6）
OD 值/空白组 OD 值×100%。每组设 6 个复孔，实验重
剂量/ 细胞存活率/ LDH/ CAT/ GSH/ MDA/ SOD/
复3次。 组别 （μmol/L） % （U/L） （μmol/L） （μmol/L） （nmol/mL） （μmol/L）
2.3 细胞上清液中 LDH、CAT、GSH、MDA、SOD 含量 空白组 100.00±0.54 653.46±42.28 7.733±0.273 29.16±2.92 0.757±0.047 36.93±3.81
模型组 53.96±0.27 2 043.56±137.53 2.270±0.312 14.02±3.47 3.514±0.187 15.93±2.49 a
a
a
a
a
a
检测
b
b
尼莫地平组 5 71.18±0.48 b 815.84±36.72 5.476±0.162 23.49±2.84 1.730±0.124 29.94±3.54 b
b
b
b
取处于对数生长期的 PC12 细胞，按“2.1”项下方法 ST-11组 5 61.83±0.18 1 734.65±210.53 3.105±0.505 18.99±3.34 2.622±0.169 22.16±2.96 b
b
b
b
b
10 67.13±0.55 b 863.36±64.59 4.934±0.294 21.44±2.02 2.108±0.215 27.27±2.31 b
b
b
b
b
接种、分组、给药、造模。复糖复氧4 h后，收集细胞上清
b
b
b
20 84.88±0.25 b 704.95±31.18 5.872±0.425 24.47±3.06 1.324±0.285 31.22±3.38 b
b
液，检测其中LDH、CAT、GSH、MDA、SOD含量。每组设 a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
6个复孔，实验重复3次。严格按照试剂盒说明书操作。 3.2 ST-11对OGD/R损伤的PC12细胞上清液中LDH、
2.4 细胞凋亡率和ROS、MMP水平检测 CAT、GSH、MDA、SOD含量的影响
采用流式细胞术进行检测。取处于对数生长期的 与空白组比较，模型组细胞上清液中LDH、MDA含
4
PC12细胞，以5×10 个/mL接种于6孔板中，每孔2 mL， 量均显著升高（P＜0.05），CAT、GSH、SOD 含量均显著
按“2.1”项下方法分组、给药、造模。复糖复氧4 h后，细 降低（P＜0.05）；与模型组比较，各药物组细胞上清液中
胞用磷酸盐缓冲液清洗3次，离心。收集细胞，使用流式 LDH、MDA含量均显著降低（P＜0.05），CAT、GSH、SOD
细胞仪检测其凋亡率和ROS、MMP水平。每组设6个复 含量均显著升高（P＜0.05），且有一定的浓度依赖性趋
孔，实验重复3次。严格按照试剂盒说明书操作。 势。结果见表1。
2.5 细胞中Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达检测 3.3 ST-11对OGD/R损伤的PC12细胞凋亡率的影响
采用Western blot法进行检测。按“2.4”项下方法接 与空白组比较，模型组细胞的凋亡率显著增加（P＜
种、分组、给药、造模。复糖复氧 4 h 后，收集细胞，用 0.05）；与模型组比较，各药物组细胞的凋亡率均显著降
低（P＜0.05）。结果见表2、图2。
4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液清洗 2 次后进行蛋白提取，采
表2 ST-11 对 OGD/R 损 伤 的 PC12 细 胞 凋 亡 率 和
用BCA试剂盒测定蛋白浓度后于100 ℃加热5 min使蛋
ROS、MMP水平的影响（x±s，n＝6）
白变性。取变性蛋白20 μg，进行12%十二烷基硫酸钠-
组别 剂量/（μmol/L） 细胞凋亡率/% ROS MMP
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并以湿法转移至聚偏二氟乙 空白组 1.49±0.16 3 448.25±194.23 6 012.34±207.07
烯膜上，用0.05 g/mL脱脂奶粉封闭2 h；洗膜后，分别加 模型组 34.46±0.41 a 18 760.58±426.12 a 3 492.27±301.46 a
尼莫地平组 5 15.16±0.25 b 8 883.37±243.47 b 5 346.36±179.53 b
入 Bax、Bcl-2、caspase-3、GAPDH 一抗（稀释比例分别为 ST-11组 5 25.15±0.32 b 11 382.49±301.59 b 4 013.89±157.27 b
1∶5 000、1∶1 000、1∶500、1∶10 000），4 ℃孵育过夜；洗膜 10 19.72±0.27 b 9 357.14±236.78 b 4 737.57±243.58 b
20 10.28±0.19 b 5 174.61±157.45 b 5 711.49±198.24 b
后，加入相应二抗（稀释比例为1∶15 000），继续孵育2 h；
a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
洗膜后，采用 ECL 发光试剂避光显色，并使用凝胶成像
3.4 ST-11 对 OGD/R 损伤的 PC12 细胞 ROS、MMP 水
系统成像，通过Image J软件进行分析，以目的蛋白与内
平的影响
参蛋白（GAPDH）的灰度值比值作为目的蛋白的相对表
与空白组比较，模型组细胞的 ROS 水平显著升高，
达量，以Bcl-2/Bax比值表示细胞凋亡走向（Bcl-2/Bax比 MMP 水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各药物
值升高，细胞凋亡受到抑制；Bcl-2/Bax比值下降，细胞凋 组细胞的 ROS 水平均显著降低，MMP 水平均显著升高
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亡得以增加 ）。每组设3个复孔，实验重复3次。 （P<0.05）。结果见表2、图3、图4。
2.6 统计学方法 3.5 ST-11 对 OGD/R 损伤的 PC12 细胞中 Bax、Bcl-2、
采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。结果以 caspase-3蛋白表达的影响
x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两 与空白组比较，模型组细胞中Bax、caspase-3蛋白的
比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。 相对表达量均显著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白的相对表
· 662 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 6 中国药房 2023年第34卷第6期