Page 27 - 《中国药房》2023年6期
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脑卒中是全球人口致残和死亡的主要原因之一，其                         器设备有限公司），ReadMax1500型酶标仪（上海闪谱生
                                                       [1]
          中缺血性脑卒中占 80%～85%，严重威胁人类健康 。                        物科技有限公司），FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD
          目前，临床治疗缺血性脑卒中的有效、直接手段是溶栓，                          公司）等。
          但当脑组织再次恢复血流供应时会引起脑缺血再灌注                            1.2 主要药品与试剂
                                                 [2]
          损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIR） ，从而导      ST-11 原 料 药（纯 度 97.5%）由 本 课 题 组 自 制 ；
          致神经细胞发生不可逆凋亡。                                      Na2S2O4 （批号 20210101）购自重庆川东化工（集团）有限
              川芎嗪是从伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong              公司；尼莫地平对照品（阳性对照，批号 25290，纯度＞
          Hort. 干燥根茎中提取的生物碱单体，具有镇痛、改善微                       98%）购自上海皓元生物医药科技有限公司；乳酸脱氢
          循环、抗氧化、抗血小板聚集等作用 。现代药理学研究                          酶（lactate dehydrogenase，LDH）、过氧化氢酶（catalase，
                                        [3]
                                                       [4]
          表明，川芎嗪对CIR所致神经损伤有一定的保护作用 ，                         CAT）、SOD、MDA、GSH、ROS 试 剂 盒（批 号 分 别 为
          但该成分具有半衰期短、代谢快、生物利用度低等缺点，                          20210901、20210825、202170729、20210727、20210529、
                                                             202010921）均购自南京建成生物工程研究所；Annexin
          故其临床应用大大受限。
                                                             Ⅴ-FITC/PI 试剂盒（批号 MA0220-Apr-25H）购自大连美
              灯盏乙素主要以苷元形式被小肠吸收，药效学实验
                                                             仑生物科技有限公司；特级马血清和 MTT、线粒体膜电
          表明，灯盏乙素苷元有和灯盏乙素类似的药效，可升高
                                                             位（mitochondrial membrane potential，MMP）、BCA 试剂
          谷胱甘肽（glutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（super‐
                                                             盒（批号分别为 809N051、810K051、20211024、20210901）
          oxide dismutase，SOD）含量，显著降低丙二醛（malondial‐
                                                             均购自北京索莱宝科技有限公司；兔源 B 细胞淋巴瘤 2
          dehyde，MDA）含量，抑制活性氧（reactive oxygen spe‐
                                                             相关 X 蛋白（B-cell lymphoma 2 related X protein，Bax）、
          cies，ROS）产生，对 CIR 致神经损伤有较好的保护作
                                                             B 细胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、胱天蛋白酶
          用 [5―6] 。但灯盏乙素苷元同样也存在稳定性差、水溶性
                                                             3（caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-
          差、口服生物利用度低等不足。
                                                             phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体（批号分
              基于川芎嗪和灯盏乙素苷元良好的氧自由基清除
                                                             别为 00102164、00097984、00101520、00106413）均购自
          活性，以及二者对 CIR 致神经损伤的保护作用，本课题
                                                             武汉三鹰生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的山
          组将这两种成分以不同的天然氨基酸为链接子，拼接合
                                                             羊抗兔免疫球蛋白 G 二抗（批号 GR3384862-12）购自美
          成得到一系列川芎嗪-灯盏乙素苷元孪药。与川芎嗪、
                                                             国 Santa Cruz 公司；超敏 ECL 化学发光试剂盒（批号
          灯盏乙素苷元原药相比，孪药的理化性质良好，且具有
                                                             20220211）购自新赛美生物科技有限公司；胎牛血清和
          较好的抗氧化、抗凝血活性，尤以 ST-11（化学结构式见
                                                             无糖DMEM、高糖DMEM培养基（批号分别为2232241、
          图 1）较为突出    [7―9] ，但其具体的神经保护作用机制尚未
                                                             8122153、8122194）均购自美国Gibco公司。
          完全清楚。氧糖剥夺/再灌注（oxygen-glucose depriva‐
                                                             1.3 细胞
          tion/reperfusion，OGD/R）致 PC12 细胞损伤是模拟 CIR
                                                                 大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12（高分化）细胞购
                                       [10]
          致神经损伤的经典体外细胞模型 。本课题组拟通过
                                                             自中国科学研究院上海细胞所。
          建立 OGD/R 致 PC12 细胞损伤模型，进一步探讨 ST-11                 2 方法
          对该神经细胞的保护作用及可能机制，为缺血性脑卒中
                                                             2.1 分组、给药与造模
          防治药物的研发提供参考。                                           取处于对数生长期的PC12细胞，以5×10 个/mL接
                                                                                                    4
                                                             种至96孔板中，每孔100 μL，放入37 ℃、5%CO2培养箱
                                                             中培养24 h后，将细胞分为空白组、模型组、尼莫地平组
                                                                                [11]
                                                            （阳性对照，5 μmol/L ）、ST-11 不同浓度组（5、10、20
                                                             μmol/L，根据前期预实验结果设置）。预先给药干预 24
                      图1 ST-11的化学结构式
                                                             h 后，除空白组细胞加入高糖 DMEM 完全培养基（84%
          1 材料                                               高糖 DMEM 培养基+10% 胎牛血清+5% 马血清+1% 青-

          1.1 主要仪器                                           链霉素双抗）100 μL 外，其余各组细胞均加入含 10
              本研究使用的主要仪器有150i型CO2恒温培养箱、                      mmol/L Na2S2O4的无糖DMEM培养基100 μL ，缺氧缺
                                                                                                    [12]
          ChemiDocXRS+型凝胶成像系统（美国 Thermo Fisher               糖培养4 h；吸弃上清液，各组细胞以高糖DMEM完全培
          Scientific 公司），SCSJ-Ⅱ-20L 型纯水仪（济南爱来宝仪              养基复糖复氧继续培养4 h。


          中国药房  2023年第34卷第6期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 6    · 661 ·
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