Page 61 - 《中国药房》2023年4期
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究却相对较少。硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是一种气              （glyceraldehyde-3-phos-phate  dehydrogenase，GAPDH）
                    [3]
          体信号分子 ，在调节细胞信号传导、抗炎、抗氧化等病                          抗体（货号 GB12002）购自武汉赛维尔生物科技有限公
                                       [4]
          理生理学过程中发挥着重要作用 。去乙酰化酶 3（sir‐                       司；SIRT3 干扰 RNA（SIRT3 siRNA，批号 20180312-1）、
          tuin 3，SIRT3）是组蛋白去乙酰化酶Ⅲ的成员之一，可参                    阴性对照干扰RNA（negative control siRNA，NC siRNA；
          与感知细胞能量代谢，进而维持氧化还原状态的平衡 。                          批号20180312-2）均购自上海吉玛制药技术有限公司。
                                                       [5]
          H2S 是一种具有抗氧化作用的气体分子，SIRT3 与线粒                      1.3 实验动物
          体功能和氧化应激密切相关。既往研究证实，H2S 可通                             1～3 d 龄的 SD 雄性大鼠（体质量为 5～8 g）由南通
          过增强 SIRT3 的表达来改善血管紧张素Ⅱ（angiotensin                 大学实验动物中心提供，使用许可证号为 SYXK（苏）
                                  [6]
          Ⅱ，Ang Ⅱ）诱导的心肌肥大 。由于Ang Ⅱ会诱导心肌                      2017-0046，生产许可证号为 SCXK（苏）2019-0001。所
                [7]
          纤维化 ，且既往研究发现 H2S 可以减轻阿霉素诱导的                        有大鼠饲养于无菌环境中，温度约为27 ℃，相对湿度约
                    [8]
          心肌纤维化 ，但是目前尚不清楚SIRT3是否也在H2S抗                       为55%，自由饮水、进食。
          Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化中起关键作用。因此，本研究                         2 方法
          拟采用硫氢化钠（sodium hydrosulfide，NaHS）作为 H2S            2.1 心肌成纤维细胞的培养
          供体，观察 SIRT3 在 H2S 抗 Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细                     取 1～3 d 新生 SD 雄性大鼠心脏，并用胰蛋白酶水
          胞增殖中的变化，揭示H2S抗心肌纤维化的新靶点，从而                         浴消化，取出细胞悬液，留取沉淀（即细胞）于细胞培养
          为临床防治心肌纤维化相关疾病提供理论依据和实验                            箱中培养。根据差速离心法分离心肌成纤维细胞。待
          基础。                                                细胞生长密度达到80%后传代，采用第3代心肌成纤维
          1 材料                                               细胞进行实验。
          1.1 主要仪器                                           2.2 心肌成纤维细胞的分组、给药与造模
              本研究所用主要仪器有 AE-100 型电子天平（美国                         将心肌成纤维细胞按每孔 1 mL（密度为 2×10                  5
          Millipore 公司）、SYNERGY H1 型全自动酶标仪（美国                个/mL）接种于6孔板中，待心肌成纤维细胞生长密度约
          BioTek公司）、TCS SP8型激光共聚焦显微镜（德国Leica                 60% 时，将含 10% 胎牛血清的培养液换成含 0.5% 胎牛
          公司）、Chemidoc Tonch 型化学发光显影仪（美国 Bio-                血清的培养液饥饿细胞 24 h 后，将细胞分为空白组、
          Rad 公司）、MVS-83 型压力蒸汽灭菌器（日本 Panasonic               Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+NaHS 组、NaHS 组，每组 6 个复孔。
          产业株式会社公司）、5424 R 型高速台式离心机（德国                       Ang Ⅱ+NaHS 组以及 NaHS 组中加入 NaHS 溶液（50
          Eppendorf公司）等。                                     µmol/L）预处理4 h，Ang Ⅱ组以及Ang Ⅱ+NaHS组加入
          1.2 主要药品与试剂                                        Ang Ⅱ溶液（100 nmol/L）刺激细胞24 h从而诱导产生心
              青霉素-链霉素溶液（批号 C0222）、胰蛋白酶（批号                    肌成纤维细胞增殖模型，观察 NaHS 给药后对心肌成纤
                                                                                                     [6]
          C0201）、CCK-8 试剂盒（批号 C0038）、4′，6-二脒基-2-             维细胞增殖的影响。给药剂量按参考相关文献 设置。
          苯 基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，批号        2.3 心肌成纤维细胞增殖的检测
          C1005）、Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔 IgG 二抗（批号                细胞分组和处理同“2.2”项下，按照 CCK-8 试剂盒
          A0423）和Cy3标记山羊抗兔IgG二抗（批号A0516）均购                   说明书方法进行操作，检测各组细胞的光密度（optical
          自 上 海 碧 云 天 生 物 技 术 有 限 公 司 ；DMEM（批 号              density，OD）值。
          SH30021.01）购 自 美 国 Cytiva 公 司 ；胎 牛 血 清（批 号         2.4 心肌成纤维细胞中羟脯氨酸含量的检测
          10099141C）购自美国Gibco公司；NaHS（批号16721-80-                 细胞分组和处理同“2.2”项下，按照羟脯氨酸测定试
          5）购 自 瑞 士 Admas 公 司 ；Ang  Ⅱ（批 号 A9525，纯 度          剂盒说明书方法进行操作，利用试剂盒提供的羟脯氨酸
          100%）购自美国Sigma-Aldrich公司；羟脯氨酸测定试剂                  标准品，按公式（羟脯氨酸含量＝各组样品吸光度/标准
          盒（批号 A030-1-1）购自南京建成生物工程研究所有限                      品吸光度×标准品浓度）计算各组心肌成纤维细胞中羟
          公司；脂质体 2000（批号 11668-019）购自美国 Invitrogen           脯氨酸含量。
          公司；兔源 SIRT3、视神经萎缩蛋白 1（optic atrophy pro‐           2.5 心肌成纤维细胞中SIRT3蛋白表达水平的检测
          tein 1，OPA1）多克隆抗体均购自美国 Santa Cruz Bio‐                 采用 Western blot 法进行检测。细胞分组和处理同
          technology公司，货号分别为sc-365175、sc-393296；兔源          “2.2”项下，用细胞裂解液裂解细胞 40 min，提取细胞总
          Ⅰ型胶原（collagen Ⅰ，Col Ⅰ）、Ⅲ型胶原（collagen Ⅲ，            蛋白。将转膜盒置于 4 ℃环境中 260 mA 通电 90 min，
          Col Ⅲ）多克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公                         将转好的膜于5%牛奶中封闭2 h，加入SIRT3（稀释比为
          司，货号分别为BA2023、M00788；甘油醛-3-磷酸脱氢酶                   1∶2 000）及GAPDH（稀释比为1∶5 000）一抗于4 ℃摇床


          中国药房  2023年第34卷第4期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 4    · 439 ·
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