Page 62 - 《中国药房》2023年4期

孵育过夜后用 TBST 洗膜，加入 Alexa Fluor 488 标记山 SNK检验。检验水准α＝0.05。
羊抗兔IgG二抗室温孵育2 h。采用ECL化学发光法曝 3 结果
光，Image J软件分析各条带的灰度值，各条带的灰度值 3.1 H2S 对 Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖和羟脯
与内参蛋白GAPDH灰度值的比值表示蛋白表达水平。 氨酸含量的影响
2.6 转染 NC siRNA 或 SIRT3 siRNA 后心肌成纤维细 与空白组相比，Ang Ⅱ组细胞 OD 值和羟脯氨酸含
胞中SIRT3蛋白表达水平的检测 量均显著升高（P＜0.05）；与 Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+
采用 Western blot 法进行检测。取稀释过的脂质体 NaHS 组细胞 OD 值和羟脯氨酸含量均显著降低（P＜
2000 分别和 NC siRNA 或 SIRT3 siRNA（稀释比均为 1∶ 0.05）。实验结果表明，H2S可以显著抑制Ang Ⅱ诱导的
1 000）混合，加入到心肌成纤维细胞培养皿中，分为NC 心 肌 成 纤 维 细 胞 增 殖 ，降 低 羟 脯 氨 酸 含 量 。 结 果
siRNA组及SIRT3 siRNA组。待细胞转染4 h后，弃除转
见图1。
染复合物，用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞
1.5 4
后更换成含 10% 胎牛血清的培养液培养 48 h 后进行检 a （ μg/mL ） a
1.0 b 3 b
测。每个样本平行检测6次。 OD值 2
2.7 心肌成纤维细胞转染后的分组、给药与造模 0.5 羟脯氨酸含量/ 1
心肌成纤维细胞转染 NC siRNA 或 SIRT3 siRNA 0 0
AngⅡ+ NaHS组
后，将细胞分为NC siRNA组、NC siRNA+Ang Ⅱ组、NC 空白组 AngⅡ组 NaHS组 空白组 AngⅡ组 AngⅡ+ NaHS组
NaHS组
siRNA+Ang Ⅱ +NaHS 组 或 SIRT3 siRNA 组 、SIRT3 A.细胞增殖 B.羟脯氨酸含量
a：与空白组相比，P＜0.05；b：与Ang Ⅱ组相比，P＜0.05
siRNA+Ang Ⅱ组、SIRT3 siRNA+Ang Ⅱ+NaHS 组。NC
图1 H2S对Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖及羟脯
siRNA+Ang Ⅱ+NaHS 组、SIRT3 siRNA+Ang Ⅱ+NaHS 氨酸含量的影响（n＝6）
组 中 加 入 NaHS 溶 液（50 µmol/L）预 处 理 4 h，NC
3.2 H2S 对 Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞中 SIRT3 蛋
siRNA+Ang Ⅱ组、NC siRNA+Ang Ⅱ+NaHS 组、SIRT3
白表达的影响
siRNA+Ang Ⅱ组、SIRT3 siRNA+Ang Ⅱ+NaHS 组中加
与空白组相比，Ang Ⅱ组细胞中 SIRT3 蛋白表达水
入Ang Ⅱ溶液（100 nmol/L）刺激细胞24 h从而诱导产生
平显著降低（P＜0.05）；与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+NaHS
心肌成纤维细胞增殖模型，观察 NaHS 对心肌成纤维细
组细胞中 SIRT3 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。实
胞增殖的影响，每组6个复孔。
验结果表明，H2S 可以显著提高 Ang Ⅱ刺激后心肌成纤
2.8 心肌成纤维细胞转染后增殖及羟脯氨酸含量的
维细胞中SIRT3蛋白表达。结果见图2。
检测
细胞分组和处理同“2.7”项下。按照 CCK-8 试剂 SIRT3 28 kDa
盒、羟脯氨酸测定试剂盒说明书方法进行检测。 GAPDH 36 kDa
2.9 心肌成纤维细胞转染后Col Ⅰ、Col Ⅲ、OPA1蛋白
1.5
表达水平的检测
采用免疫荧光法进行检测。细胞分组和处理同 SIRT3/GAPDH 1.0 b
“2.7”项下，用PBS清洗细胞，固定细胞20 min后弃掉固 0.5 a
定液，再用 PBS 清洗细胞，封闭细胞 1 h 后弃掉封闭液，
0
加入Col Ⅰ、Col Ⅲ、OPA1一抗（稀释比均为1∶50），4 ℃ 空白组 AngⅡ组 AngⅡ+ NaHS组
NaHS组
过夜后用 PBS 洗涤细胞，按 1∶100 的稀释比加入 Alexa a：与空白组相比，P＜0.05；b：与Ang Ⅱ组相比，P＜0.05
图2 H2S对Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞中SIRT3蛋
Fluor 488标记山羊抗兔IgG二抗（用于Col Ⅰ）和Cy3标
白表达的影响
记山羊抗兔 IgG 二抗（用于 Col Ⅲ、OPA1），室温避光放
置2 h。用DAPI染细胞核，将载玻片置于荧光显微镜上 3.3 转染 NC siRNA 或 SIRT3 siRNA 后对心肌成纤维
拍片，用Image J软件测定荧光强度，荧光强弱间接反映 细胞中SIRT3蛋白表达的影响
Col Ⅰ、Col Ⅲ、OPA1蛋白表达水平。 与NC siRNA组相比，SIRT3 siRNA组细胞中SIRT3
2.10 统计学分析 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。实验结果表明，用
采用 SPSS 25.0 软件进行处理，实验数据以 x±s 表 干扰 RNA 技术成功下调细胞中 SIRT3 蛋白表达。结果
示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用 见图3。

· 440 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 4 中国药房 2023年第34卷第4期