Page 37 - 《中国药房》2023年4期
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取血后处死，取右侧胫骨，剔除肌肉，用生理盐水冲洗干                          least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），以变量投
          净，以保鲜膜和锡纸包裹后，分装在密封袋中并标记，置                          影重要性（variable importance in the project，VIP）值＞1
          于－80 ℃保存备用。                                        且 P＜0.05 为标准，筛选各组间差异代谢物。同时借助
          2.4 血清中骨代谢与氧化应激指标含量的检测                             PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、人类代谢
              采用酶联免疫吸附测定法，参照试剂盒说明书检测                         组数据库（HMDB）（http：//www.hmdb.ca/）以及化学标准
          血 清 中 骨 代 谢 指 标（HYP、ALP）及 氧 化 应 激 指 标              品对上述差异代谢物进行结构鉴定。最终采用Metabo‐
         （TAOC、SOD、MDA）的含量。                                  Analyst（http：//www.metaboanalyst.ca/）进行生物代谢通
          2.5 骨微结构的检测                                        路分析。基于通路富集分析和通路拓扑分析，以－lg（P）
              采 用 PET/CT 扫 描 各 组 大 鼠 右 侧 胫 骨 ，并 使 用          值＞2 和通路影响阈值＞0.05 为标准，确定蓝刺头主要
          micro-CT骨分析软件进行分析，评价各组大鼠右侧胫骨                       影响的代谢通路。
          密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁厚度（trabecu‐        2.7 统计学分析
          lar thickness，Tb·Th）、骨小梁数量（trabecular number，          采用 SPSS 19.0 软件对组间的差异进行统计学分
          Tb·N）、骨小梁间距（trabecular separation，Tb·Sp）。同         析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采
          时在感兴趣区域图像中测量胫骨中轴处皮质骨的骨体                            用Bonferroni法。检验水准α＝0.05。
          积分数（bone volume fraction，BVF）、骨表面积/骨体积比            3 结果
          值（bone surface/bone volume，BS/BV）。                 3.1 各组大鼠血清中骨代谢及氧化应激指标含量的比较
          2.6 代谢组学研究                                             与空白组相比，模型组大鼠血清中 HYP、ALP、
          2.6.1 溶液的制备 （1）样本溶液：取出冻存的各组大                       MDA 含量均显著升高（P＜0.05），TAOC 与 SOD 含量均
          鼠血清，于 4 ℃下解冻。取 200 µL 血清样品，采用 3 倍                  显著降低（P＜0.05）。相较于模型组，给予高、中、低剂
          体积甲醇进行蛋白沉淀。将血清与甲醇混合物涡旋 5                           量的蓝刺头冻干粉药液及骨疏康药液可显著降低大鼠
          min，于 4 ℃下 14 000 r/min 离心 10 min；随后取上清液，          血清中 HYP、ALP（蓝刺头低剂量组除外）、MDA 含量
          减压离心、浓缩干燥后，用100 µL甲醇复溶，涡旋5 min，                   （P＜0.05），显著升高大鼠血清中 TAOC（蓝刺头低剂量
          14 000 r/min 离心 10 min，取上清液置于进样瓶中备用。               组除外）、SOD含量（P＜0.05）。结果见图1。
         （2）质量控制（quality control，QC）样本溶液：另分别吸取
                                                               20       b               60    a
          所有血清样本各 10 μL 混合为 QC 样本，处理方法同                        15                b                  b
         “2.6.1（1）”项下，取上清液置于进样瓶中备用。                            （ U/mL ）  10  a  b      （ ng/mL ）  40  b  b  b
          2.6.2 色谱条件与质谱条件 （1）色谱条件：以 Thermo                     TAOC/  5                HYP/  20
          Hypersil PFP（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）为色谱柱进行
                                                                0                        0
          分离，以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度                           Ⅰ   Ⅱ   Ⅲ   Ⅳ   Ⅴ   Ⅵ    Ⅰ   Ⅱ   Ⅲ   Ⅳ   Ⅴ   Ⅵ
                                                                       A. TAOC                   B. HYP
          洗脱（0～1 min，2%B→5%B；1～10 min，5%B→46%B；                20                        3
                                                                      a                          b
          10～20 min，46%B→80%B；20～35 min，80%B→100%B）；           15                                      b  b
          柱温为35 ℃，进样量为5 µL，流速为0.3 mL/min。（2）质谱                 （ ng/mL ）  10  b  b  b  （ ng/mL ）  2  a  b
          方法：采用电喷雾电离源，在 full ms/dd ms 模式下进行                    ALP/  5                 SOD/  1
                                              2
          数据采集。具体采集参数设置喷雾电压为3.5 V（+）/2.8
                                                                0                        0
          V（－），毛细管温度为400 °C（+）/350 °C（－），鞘气（N2 ）                  Ⅰ   Ⅱ   Ⅲ   Ⅳ   Ⅴ   Ⅵ    Ⅰ   Ⅱ   Ⅲ   Ⅳ   Ⅴ   Ⅵ
                                                                        C. ALP                   D. SOD
          流速为 40 psi（+）/35 psi（－），辅助气体（N2 ）流速为 5                           400
          psi，S-lens RF 水平为 50.0，一级质谱扫描范围为 m/z                             300    a
          100～1 100，二级质谱扫描范围为m/z 50～750。                                   （ ng/mL ）  200  b  b  b  b
          2.6.3 分析方法稳定性与精密度考察 在样本分析过                                       MDA/  100
          程中插入 QC 样本溶液进行分析，以 QC 样本溶液中在
                                                                             0
          正、负离子模式下6个随机化合物保留时间和峰面积的                                             Ⅰ   Ⅱ   Ⅲ   Ⅳ   Ⅴ   Ⅵ
                                                                                    E. MDA
          RSD为指标评价分析方法的稳定性与精密度。                                 Ⅰ：空白组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：骨疏康组；Ⅳ：蓝刺头低剂量组；Ⅴ：蓝
          2.6.4 数据处理 液质联用仪采集的原始数据文件通                         刺头中剂量组；Ⅵ：蓝刺头高剂量组；a：与空白组相比，P＜0.05；b：与
          过 Discoverer Compound（CD）  2.0 软件进行峰识别、峰           模型组相比，P＜0.05
                                   TM
          筛选、峰提出以及峰面积的自动计算，最终形成兼具化                           图1 各组大鼠骨代谢及氧化应激血清指标比较（n＝6）
          合物名称、保留时间、分子量、分子式、峰面积、mzCloud                      3.2 各组大鼠骨微结构变化比较
          等信息的多维峰表。将上述峰表导入 SIMCA-P 14.1 软                        与空白组相比，模型组大鼠 BS/BV、Tb·Sp 水平均
          件进行正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial                显著升高（P＜0.05），BMD、BVF、Tb·Th、Tb·N水平均显


          中国药房  2023年第34卷第4期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 4    · 415 ·
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