Page 83 - 《中国药房》2023年3期
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美国Abcam公司。                                         进行腹腔注射麻醉后，经腹主动脉采血，以 3 000 r/min
          1.3 动物                                             离心 10 min，取上清液存于－80 ℃条件下，备用。取血
              SPF级健康SD大鼠80只，雄性，约12周龄，体质量                     后将大鼠处死，迅速取其肝组织适量，以生理盐水清洗
         （238.56±17.17） g，由海南省药品检验所提供，实验动物                   多次 ，之后置于液氮中冻存约 30 min，取出后冻存
          使用许可证号为 SYXK（琼）2021-0009。大鼠饲养于温                    于－80 ℃条件下，备用。另再取肝组织适量，以 4% 多
          度 20～26 ℃、相对湿度（55±15）%的安静环境下，避免                    聚甲醛固定处理 24 h，用于肝组织苏木素-伊红（HE）染
          强光照射，按需饮水、摄食，均经1周基础饲料适应性喂                          色及过碘酸-雪夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色。
          养，再进行后续实验。本研究经中南大学湘雅医学院附                           2.5 血清脂代谢指标检测
          属海口医院生物医学伦理委员会审核批准，伦理批件号                               取“2.4”项下血清适量，常规解冻后与相应试剂盒工
          为2020-（伦审）-252。                                    作液充分混匀，37 ℃孵育 5～10 min，用酶标仪进行测
          2 方法                                               定。采用葡萄糖氧化酶法检测血清中 TG 水平，检测波
          2.1 余甘子水提物的制备与给药剂量                                 长为510 nm；采用酶法检测血清中TC水平，检测波长为
              取新鲜余甘子，以清水进行清洗，去核，以果肉10倍                       510 nm；采用直接法检测血清中LDL-C、HDL-C水平，检
          量（mL/g）的蒸馏水浸泡 0.5 h，再煎煮 2 次、每次 1 h，过               测波长为546 nm。
          滤提取液，合并2次滤液，减压浓缩至约100 mL体积；加                       2.6 血清胰岛素相关指标检测及计算
          入适量4%明胶水溶液，边加热边搅拌，混匀后再次过滤                              取“2.4”项下血清适量，常规解冻后采用 ELISA 法
          去渣加入3倍体积的95%乙醇，作用24 h后，过滤，取滤
                                                             测定血清FINS水平，严格遵从试剂盒说明书进行操作，
          液，浓缩至提取物相对密度为 2 g/mL，保存备用。使用
                                                             并计算胰岛素抵抗指数（insulin resistance index，IRI）及
          前以蒸馏水进行稀释。参考文献[9]，将余甘子的成人用
                                                             胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index，ISI）。IRI＝
          量（3～9 g）换算为大鼠的给药剂量，采用 800、400、200
                                                             FBG×FINS/22.5，ISI＝1/（FBG×FINS），其中ISI为非正
          mg/kg 3 个剂量给药，分别相当于成人最低给药剂量的
                                                             态分布，以其自然对数为最终结果。
          3、1.5、0.75 倍等效剂量；参考文献[10]，由吡格列酮的成
                                                             2.7 肝组织病理形态观察
          人剂量换算为大鼠的给药剂量（2.7 mg/kg）。按照大鼠
                                                                 采用HE染色法进行观察。包埋切片：取“2.4”项下
          5 mL/kg的体积进行灌胃。
                                                             经固定处理的肝脏，进行常规石蜡包埋切片，切片厚度
          2.2 分组、造模与给药
                                                             4 μm。脱蜡：切片经温箱适当烤干后，投入二甲苯中脱
              将80只SD大鼠按照体质量进行随机分组，其中10
                                                             蜡处理5～10 min，待蜡彻底溶解后，再移入100%、90%、
          只为空白组，给予基础饲料喂养；其余70只根据参考文
                                                             80%、70%乙醇分别处理约2 min，之后清水洗去乙醇，最
          献[11]建立 IR 模型：大鼠以高糖高脂饲料连续喂养 4 周
                                                             后以蒸馏水处理2 min。HE染色顺序：苏木素染液染色
          后，提前禁食12 h，空腹称其体质量，于左腹下侧单次注
                                                             5 s，1% 盐酸-乙醇溶液分化 30 s，流水冲洗至返蓝（约 5
          射 STZ（溶剂为 0.1 mol/L 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液），
                                                             min）；伊红染液染色5 s，再经80%、90%、100%乙醇梯度
          剂量为 35 mg/kg。3 d 后经尾部取血检测其空腹血糖
                                                             脱水后，移入二甲苯中透明处理约5 min。封固：迅速擦
         （fasting plasma glucose，FPG）水平 ，测得 FPG 水平＞
          16.7 mmol/L并持续至少10 d则认为造模成功。最终有                    去组织外围的二甲苯，滴入树胶，以干净的盖玻片盖在
                                                             树胶上，调整盖玻片位置，待封固并晾干后，于显微镜下
          62 只大鼠造模成功，取造模成功的大鼠 50 只随机分为
          模型组、阳性对照组和余甘子水提物高、中、低剂量组，                          观察肝组织的病理形态变化并拍照。
                                                             2.8 肝组织中糖原表达情况观察
          每组各 10 只。余甘子水提物各剂量组大鼠给予相应浓
          度的余甘子水提物稀释液，阳性对照组大鼠给予配制好                               采用 PAS 染色法进行观察。取“2.7”项下脱蜡后的
          的吡格列酮溶液，空白组及模型组大鼠则给予等体积的                           肝组织切片，以蒸馏水冲洗1～2 min后，用0.5%过碘酸
          生理盐水。所有大鼠每日灌胃1次，连续4周。                              浸泡氧化处理 10 min，蒸馏水再冲洗 3 次，每次至少 5
          2.3 大鼠一般状态观察及体质量测定                                 min；置于雪夫试剂中显色处理15 min，经流水冲洗3次，
              于实验开始时及开始后的每一周均观察并记录大                          每次约5 min；苏木素复染2 min，1%盐酸-乙醇溶液分化
          鼠的精神状态、毛发光泽度、摄食、饮水、尿量及体质量                          30 s，流水冲洗至返蓝（约5 min），再通过乙醇梯度洗脱，
          变化情况。称体质量时，大鼠需在空腹条件下至少禁食                           透明和封固处理同“2.7”项下。最后，经显微镜观察并拍
          12 h，但不禁水。                                         照后，用Image-Pro Plus 6.0软件分析肝组织中糖原染色
          2.4 标本采集                                           面积（以像素点计）。肝组织糖原经PAS染为紫红色，染
              末次灌胃后第 2 天，以 2% 戊巴比妥钠溶液对大鼠                     色面积数值越大，提示糖原密度越大、含量越高。


          中国药房  2023年第34卷第3期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 3    · 329 ·
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