Page 41 - 《中国药房》2023年2期
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TIMP-1）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号分别                     剂量），氯沙坦钾的灌胃剂量为10 mg/kg，A779组的腹腔
          为 E-EL-R0618c、E-EL-R0624c、E-EL-R0540c）均购自武         注射剂量为 1 mg/kg，假手术组和模型组平行灌胃蒸馏
          汉伊莱瑞特生物科技公司；可溶性致瘤性抑制因子 2                           水，每日1次，干预4周后进行后续实验，期间A779组和
         （soluble suppression of tumorigenicity-2，sST-2）ELISA试  等效剂量组大鼠因心衰过于严重各死亡1只。
          剂盒（货号 E2292r）购自武汉伊艾博科技有限公司；兔                       2.4 大鼠血清和心肌组织的取材和保存
          Mas 多克隆抗体（货号 PA5-43668）购自美国 Invitrogen                 给药4周后，将大鼠用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹
          公司；兔ACE2多克隆抗体（货号GTX101395）购自美国                     腔注射进行麻醉，待其麻醉后于腹主动脉取血，于 4 ℃
          GeneTex 公 司 ；兔 Ang-（1-7）多 克 隆 抗 体（ 货 号             下静置2 h后，以3 000 r/min离心15 min，分离血清后置
          PAS085Ra01）购自武汉优尔生商贸有限公司；Hyp 检测                    于－80 ℃冰箱保存。待完成取血后，取出大鼠心脏，用
          试剂盒（货号A030-2-1）购自南京建成生物工程研究所。                      4 ℃生理盐水清洗并剥离多余组织，再次以生理盐水清
          1.3 实验动物                                           洗2～3次后用刀片切取心室，部分放于4%多聚甲醛溶
              健康 SPF 级雄性 SD 大鼠 120 只，6 周龄，体质量                液中固定，部分置于－80 ℃冰箱保存。
         （235±15）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公                         2.5 大鼠心肌组织中胶原纤维分布的检测
          司，动物生产许可证号为SCXK（京）2016-0006。本研究                        采用Masson染色法进行观察。取各组大鼠心肌组
          所有实验过程均遵循河南中医药大学实验动物伦理委                            织适量，常规石蜡包埋，切片，按照试剂盒说明书进行
          员会指导规定进行，批件号为YFYDW2018004。                         Masson 染色，于显微镜下观察胶原纤维的分布情况（心
          2 方法                                               肌组织呈红色，胶原纤维呈蓝色）并拍照。
          2.1 葶苈大枣泻肺汤的制备                                     2.6 大鼠心肌组织中Hyp含量的检测
              取炒葶苈子15 g、大枣约12枚，以水煎法提取，所得                         采用碱水解法进行检测。取各组大鼠心肌组织约
          提取液经浓缩、干燥后粉碎，得葶苈大枣泻肺汤干粉（药                          40 mg，加碱水解液 1 mL 混匀，于沸水浴中水解 20 min
          物出膏率为7.69%，每1 g干粉相当于生药总量13 g） 。                   （每10 min混匀1次），用Hyp检测试剂盒中提供的调pH
                                                      [7]
          2.2 大鼠心梗后心衰模型的建立                                   试剂调节pH至6.0～6.8，以3 500 r/min离心后取上清液
              动物适应性喂养 3 d 后行左冠状动脉前降支结扎                       1 mL，按照试剂盒说明书进行处理，使用酶标仪于 550
          术：手术前 12 h 禁食不禁水，次日称定体质量，予 1% 戊                    nm波长处检测大鼠心肌组织中Hyp的含量。
          巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射进行麻醉，以仰卧位固定                      2.7 大鼠心肌组织中COLⅠ、COL Ⅲ蛋白表达水平的
          动物四肢，胸部备皮，酒精消毒后在心脏搏动最明显处                           检测
          开胸挤出心脏，于肺动脉圆锥与左心耳边缘交界下 1                               采用免疫组化法进行检测。每组取6只大鼠的心肌
          mm处结扎冠状动脉前降支，然后迅速将心脏放回胸腔，                          组织适量，制作蜡块并切片，脱蜡后进行抗原修复；用
          缝合皮肤后立即胸外按压数次。假手术组只穿线不结                            0.3% 过氧化氢甲醇溶液去除内源性过氧化物酶，以血
          扎。所有大鼠术后 3 d 经腹腔给予庆大霉素注射液 0.2                      清封闭，加 COLⅠ、COLⅢ一抗（稀释度分别为 1∶100、
          mL/d预防感染。术后24～72 h大鼠死亡率较高，剔除死                      1∶300）于 4 ℃孵育过夜；用 PBS 清洗，加 HRP 标记的
          亡动物，正常喂养4周，行心脏超声检测，若左室射血分                          IgG 二抗（稀释度 1∶200）于 37 ℃下孵育 1 h；用 PBS 清
          数（left ventricular ejection fraction，LVEF）≤50%，则判  洗，以 DAB 显色、苏木精复染后，行梯度乙醇脱水，封
          定为心梗后心衰模型复制成功。具体手术过程参照课                            片，于显微观察摄像系统下拍照，观察COLⅠ、COLⅢ蛋
                                        [9]
          题组前期心梗动物模型的复制方法 。                                  白的表达情况（细胞核为蓝色，阳性表达细胞为棕黄
          2.3 分组与给药                                          色），并利用 Image-Pro Plus软件分析阳性细胞的平均光
              术后 4 周 LVEF≤50% 的大鼠共 63 只（存活率约为                密度值，以表示COLⅠ、COL Ⅲ蛋白的表达水平。
          52%），其中8只大鼠只穿线不结扎，将其纳入假手术组；                        2.8 大鼠血清中纤维化相关指标含量的检测
          剩余 55 只随机分为 7 组，分别为模型组（8 只）、A779 组                     采用 ELISA 法进行检测。取“2.4”项下血清，按照
         （8 只）、A779+葶苈大枣泻肺汤等效剂量组（7 只，简称                      ELISA试剂盒说明书操作，使用酶标仪于450 nm波长处
         “A779+等效剂量组”）、A779+葶苈大枣泻肺汤高剂量组                      检测血清中纤维化相关指标（MMP-2、MMP-9、TIMP-1、
         （8只，简称“A779+高剂量组”）、葶苈大枣泻肺汤等效剂                       sST-2）的含量。
          量组（8只，简称“等效剂量组”）、葶苈大枣泻肺汤高剂量                        2.9 大鼠心肌组织中 ACE2-Ang-（1-7）-Mas 轴相关蛋
          组（8只，简称“高剂量组”）、氯沙坦钾组（8只，简称“氯沙                      白表达的检测
                                    [7]
          坦组”）。结合课题组前期研究 和药理学实验中动物与                              采用 Western blot 法进行检测。取冻存于－80 ℃
          人体间的等效剂量换算要求 ，本研究设定葶苈大枣泻                           的心肌组织，加入组织裂解液，匀浆，离心后取上清液，
                                  [10]
          肺汤的灌胃剂量分别为0.8 g/kg（等效剂量）、1.6 g/kg（高                用 BCA 法测定蛋白浓度。取变性后的蛋白样品 40


          中国药房  2023年第34卷第2期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 2    · 163 ·
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