Page 75 - 《中国药房》2022年23期
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对于乳腺癌等恶性肿瘤，以阿霉素（doxorubicin，                  （DOTAP）、二硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC）、二棕榈酰磷
          DOX）为代表的化学药治疗仍是目前临床上常用的治疗                          脂酰甘油（DPPG）均购自美国 Avanti 公司；Annexin Ⅴ-
          手段，但随着药物的反复使用，多药耐药（multiple drug                   FITC 细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒均购
          resistance，MDR）已成为化疗失败的一个重要诱因。                     自上海碧云天生物技术公司；兔源P-gp一抗购自武汉三
          MDR1 基因过表达是引发 MDR 的主要原因，其编码的                       鹰生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免
          P-糖蛋白（P-glycolprotein，P-gp）介导的药物外排是经典              疫球蛋白 G 二抗购自美国 LI-COR 公司；siRNA 由宁波
          的耐药机制     [1―2] 。纳米载体可通过高渗透长滞留效应积                  康贝生化有限公司合成。
          聚于肿瘤部位，且具有功能化程度高、生物相容性好等                           1.3 细胞
              [3]
          优点 。根据肿瘤微环境特性开发出的刺激响应型纳米                               耐 DOX 型乳腺癌 MCF-7/ADR 细胞由河南工业大
          载药系统，当其受到如微酸性、高水平谷胱甘肽（gluta‐                       学生物工程学院细胞功能调控创新实验室提供。
          thione，GSH）等微环境刺激时会迅速进入活化状态，载                      2 方法与结果
          体结构发生改变，可在抑制 MDR 型肿瘤 P-gp 表达的同                     2.1 CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的制备
          时，实现化疗药物的持续控释，从而协同增强对MDR型                              采用模板剂法 制备MSNs。取100 mg MSNs置于
                                                                             [10]
          肿瘤的治疗效果       [4—5] 。                              10 mL无水乙醇中，超声（功率50 W，频率40 kHz，下同）
              肿瘤细胞内通常呈现微酸性，且GSH水平为正常组                        20 min后加入2 mL APTES，并于60 ℃反应20 h，离心收
                          [6]
          织细胞的 3 倍以上 ，故可利用还原性差异设计出对高                         集沉淀，真空干燥即得 MSNs-NH2。向 100 mg MSNs-
          水平 GSH 敏感的还原响应型纳米载体。氧化还原反应                         NH2中加入 10 mL 丙酮，30 min 后逐滴加入 5 mL 含有
          会促进纳米载体的降解，有效降低材料对细胞的毒性，                           1.5 mol/L 乙二酸酐的丙酮溶液，室温下搅拌 24 h，所得
          常见的还原敏感键主要有二硫键（－SS－）、二硒键等，                         沉淀即为 MSNs-COOH。向 100 mg MSNs-COOH 中加
          其中－SS－和 GSH 会发生氧化还原反应，从而导致自                        入 20 mL 磷酸盐缓冲液（pH5.0）、75 mg 1-乙基-（3-二甲
          身被还原为巯基，使载体降解而释放化疗药物，进而实                           基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐、75 mg N-羟基琥珀酰亚
          现在肿瘤组织部位的靶向控释              [7―8] 。基于此，本文以介         胺，搅拌活化2 h后，向其中加入1 g半胱氨酸盐酸盐，在
          孔硅纳米粒（mesoporous silica nanoparticles，MSNs）为       氮气保护条件下于 35 ℃搅拌 24 h，离心收集沉淀即得
          基 础 制 备 MSNs-SS-NH2@DOX，并 以 阳 离 子 脂 质 体            MSNs-SS-NH2。取 MSNs-SS-NH2与 DOX 适量（两者质
         （cationic  liposomes，CLs）对 其 包 覆 制 得 CLMSNs-SS-     量比为2∶1），搅拌24 h后即得MSNs-SS-NH2@DOX。
          NH2@DOX，进一步负载小干扰 RNA（siRNA，可下调耐                        取 100 mg DOTAP、50 mg 胆固醇、30 mg DPPG、30
          药细胞中P-gp的表达，有效逆转肿瘤MDR，提高抗肿瘤                        mg DSPC、8 mL 氯仿，超声溶解后缓慢旋蒸成膜，即得
              [9]
          效果 ）得到CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA复合载药系                 CLs。取CLs与DOX适量（两者质量比为2∶1）超声融合
          统；再以耐 DOX 型乳腺癌细胞 MCF-7/ADR 为研究对                    5 min，即得CLs@DOX。将CLs分别与上述所得MSNs-
          象，考察该制剂抗MDR型肿瘤细胞的作用，以期为其开                          SS-NH2、MSNs-SS-NH2@DOX 溶液混合并超声后，即得
          发及后续临床应用提供参考。                                      CLMSNs-SS-NH2、CLMSNs-SS-NH2@DOX。将干粉状
          1 材料                                               siRNA 离心 10 min 后溶于 375 μL DEPC 水中，然后与
          1.1 主要仪器                                           CLMSNs-SS-NH2@DOX 涡旋混匀，即得 CLMSNs-SS-
              本研究所用主要仪器有 JEM-2100F 型透射电子显                    NH2@DOX/siRNA（现用现配），并以 50 nmol 为 siRNA
          微镜（日本 Hitachi 公司），Nano ZS90s 型纳米粒度仪（英              的最佳负载量。
          国 Malvern 公司），ASAP 2460 型物理吸附仪（美国麦克                2.2 CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的表征
          公司），Nicolet IS10型傅里叶红外光谱仪、Attune NxT型              2.2.1  粒 径 及 Zeta 电 位 分 析  将 适 量 MSNs-SS-
          流式细胞仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），2695         NH2@DOX、CLs@DOX、CLMSNs-SS-NH2@DOX 和
          型高效液相色谱仪（美国 Waters 公司），Axio observer3              CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA分散于去离子水中超声
          型荧光显微镜（德国Zeiss公司），DSC214型差示扫描量                     均匀，测定其粒径和 Zeta 电位。结果显示，MSNs-SS-
          热仪（德国耐驰公司），D8型X射线衍射仪（德国布鲁克                         NH2@DOX 的粒径为（153.73±15.6） nm，Zeta 电位为
          公司）。                                              （35.13±0.73） mV，多分散性指数（polydispersity index，
          1.2 主要药品与试剂                                        PDI）良好。因 CLs@DOX 表面存在大量正电荷且粒径
              DOX 原料药 （批号 N1111A，含量＞98%）、DOX 对               [ （168.77±3.84） nm]较 MSNs-SS-NH2@DOX 有所增大，
          照品 （批号 N1111AS，含量＞99%）购自大连美仑生物                     故 经 CLs 包 埋 后 CLMSNs-SS-NH2@DOX 的 粒 径
          技术有限公司；十六烷基三甲基溴化铵、3-氨丙基三乙                          [ （160.03±7.13） nm]增大且 Zeta 电位增大至（104.83±
          氧基硅烷（APTES）、乙二酸酐、二乙醇胺、硅酸四乙酯、                       1.86） mV，这说明 CLs 可有效包覆于 MSNs-SS-NH2 表
          异硫氰酸荧光素（FITC）均购自上海阿拉丁生化科技股                         面 。 进 一 步 负 载 siRNA 后 ，CLMSNs-SS-NH2@DOX/
          份 有 限 公 司 ；二 油 酰 基 三 甲 胺 丙 烷 甲 基 硫 酸 盐             siRNA 的粒径[（197.63±3.75） nm]增大，且由于核酸呈


          中国药房  2022年第33卷第23期                                              China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 23    · 2881 ·
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