Page 37 - 《中国药房》2022年23期
P. 37

2 h后，以3 000 r/min离心15 min，取上清液，置于－80 ℃             标准为≥36 分（满分 60 分）；＜36 分视为定性结果不准
          冰箱中保存备用。                                           确，则排除 ]，最后将正负离子数据合并为一个数据矩
                                                                      [7]
          2.2 大鼠心脏组织病理学形态观察                                  阵表，后续研究则以此表为基础进行分析。
              将“2.1”项下假手术组、模型组和清热活血汤各剂量                      2.4.4 药效成分分析 基于“2.4.3”项下鉴定所得化合
          组大鼠心脏组织使用预冷0.9%氯化钠溶液清洗后固定                          物，以 P＜0.05、差异倍数（fold change，FC）≥1.2 为筛选
          于4%多聚甲醛中24 h，然后进行梯度乙醇脱水、二甲苯                        条件，筛选清热活血汤含药血清相对于空白血清含量较
          透明、石蜡包埋及切片。根据试剂盒说明书方法操作，                           高的化合物，然后与黄芩、毛冬青、川芎、赤芍、降香、红
          取上述部分切片（剩余部分进行细胞凋亡水平检测）以                           花、丹参在 TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、
          二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，进行 HE 染色，采用数字                        SYMMAP（http：//www.symmap.org/）、HERB（http：//herb.
          病理切片扫描仪观察大鼠心脏组织的病理学形态变化。                           ac.cn/）数据库中收录的化学成分进行交集，以确认清热
          2.3 大鼠心脏组织中细胞凋亡水平的检测                               活血汤含药血清中的主要药效成分。
              取“2.2”项下剩余切片按TUNEL试剂盒说明书方法                     2.4.5 差异代谢物及代谢通路分析 基于“2.4.3”项下
          操作后，采用数字病理切片扫描仪扫描观察，并随机选取                          鉴定所得化合物，采用主成分分析（principal component
          6个视野使用Image J软件计算心脏组织细胞凋亡率，细胞                      analysis，PCA）、偏最小二乘分析（partial least squares dis‐
          凋亡率（%）＝绿色荧光细胞数/蓝色荧光细胞数×100%。                       crimination analysis，PLS-DA）及正交偏最小二乘判别分
          2.4 大鼠清热活血汤含药血清和空白血清的 UPLC-
                                                             析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，
          MS分析
                                                             OPLS-DA）来区分清热活血汤含药血清组与空白血清组
          2.4.1 血清样本的预处理 将“2.1”项下空白血清组和                                             [7]
                                                             之间代谢轮廓的总体差异 。采用 OPLS-DA 中变量重
          清热活血汤含药血清组的血清样本取出解冻，移取样本
                                                             要性投影（variable importance in projection，VIP）值及 t
          100 μL，加入内标（0.06 mg/mL L-2-氯苯丙氨酸）20 μL，
                                                             检验筛选组间差异代谢物（筛选标准为 VIP 值＞1，P＜
          涡旋震荡10 s；加入蛋白沉淀剂300 μL涡旋震荡1 min，                        [8]
                                                             0.05） 。 采 用 HMDB、METLIN、KEGG（https：//www.
          再于冰水浴中超声（功率 360 W，频率 40 kHz，下同）提
                                                             kegg.jp/）数据库对差异代谢物进行指认并基于KEGG数
          取10 min后，于－20 ℃条件下静置30 min；静置后，将样                  据库进行代谢通路富集分析。
          本于 4 ℃条件下以 13 000 r/min 离心 10 min，取上清液
                                                             2.5 大鼠血清中氧化应激指标水平的检测
          200 μL装入UPLC-MS进样小瓶中挥干溶剂。样本残渣
                                                                 取假手术组、模型组和清热活血汤低、中、高剂量组
          以 300 μL 甲醇复溶（涡旋 30 s，超声 3 min）后，离心 10
                                                             大鼠的全血样本适量，于 4 ℃下以 3 000 r/min 离心 15
          min，吸取上清液 150 μL，以 0.22 μm 微孔滤膜过滤后，
                                                             min。取上清液，根据试剂盒说明书方法操作后，采用比
          进行UPLC-MS分析。每组平行6份样本。
                                                             色法检测大鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px水平。
          2.4.2  UPLC-MS 条 件 （1）色 谱 条 件 ：色 谱 柱 为
                                                             2.6 统计学方法
          ACQUITYUPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱
                                                                 实验数据采用 SPSS 24.0 进行统计学分析，计量资
          温为 45 ℃；流动相为 0.1% 甲酸（A）-乙腈（B，含 0.1% 甲
                                                             料符合正态分布以 x±s 表示。多组间比较采用单因素
          酸），梯度洗脱（0～2 min，5%B；2～4 min，5%B→30%B；
          4～8  min，30%B→50%B；8～10  min，50%B→80%B；            方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验（方差齐时）或
                                                             Dunnett’s T3检验（方差不齐时）。检验水准α＝0.05。
          10～14 min，80%B→100%B；14～15 min，100%B；15～
          16 min，100%B→5%B）；流速为 0.35 mL/min；进样体积             3 结果
          为2 μL。（2）质谱条件：离子源为ESI；质荷比扫描范围为                     3.1 大鼠心脏组织病理形态学观察结果
          100～1 200；一级全扫描分辨率为 7×10 ；喷雾电压（V）                      假手术组大鼠心肌细胞纤维排列整齐、肌节清晰紧
                                            5
          为 3 500（+）、－3 000（－）；鞘气流速（Arb）为 40（+）、35           密。模型组大鼠大部分心肌细胞肿胀变形、肌丝断裂，
         （－）；辅气流速（Arb）为 10（+）、8（－）；毛细管温度为                    组织间隙水肿、白细胞浸润较明显。清热活血汤各剂量
          320 ℃；质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式。                          组心肌细胞紊乱、心肌纤维断裂有所改善，且随着给药
          2.4.3 数据预处理 UPLC-MS原始数据采用Progenesis                剂量的增加，改善越明显。结果见图1。
          QI v2.3 软件进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校                      3.2 大鼠心脏组织中细胞凋亡水平的检测结果
          正、峰对齐和归一化。化合物的鉴定基于精确质量数、                               与假手术组[（1.25±0.34）%]比较，模型组大鼠心脏
          二级碎片及同位素分布，并使用 HMDB（http：//www.                    组 织 中 细 胞 凋 亡 率 [（38.62±5.75）% ] 显 著 升 高（P＜
          hmdb.ca/）、Lipidmapsv2.3（https：//dev.lipidmaps.org/）和  0.05）。与模型组比较，清热活血汤低、中、高剂量组大鼠
          METLIN（http：//enigma.lbl.gov/metlin/）数据库进行定性       心 脏 组 织 中 细 胞 凋 亡 率 [ 分 别 为（24.59±1.17）% 、
          分析。笔者基于提取出的数据，将组内缺失值（即离子                          （21.41±3.03）% 、（15.86±3.06）% ] 均 显 著 降 低（P＜
          峰值为0）＞50%的化合物的所有离子峰以极小值的1/2                        0.05），且清热活血汤高剂量组细胞凋亡率显著低于中、
          进行替换，并根据化合物定性结果打分进行筛选[筛选                           低剂量组（P＜0.05）。结果见图2。


          中国药房  2022年第33卷第23期                                              China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 23    · 2847 ·
   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42