Page 84 - 《中国药房》2022年21期
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均自由饮水采食。本实验获河南中医药大学实验动物                             分；闭锁及无卵丘的囊性卵泡占卵泡总量的百分比≥
                                                                       [12]
          伦理委员会批准（批准号 DWLL202201010），实验过程                     75%记4分 。
          及动物处置严格遵守“3R”原则。                                    2.6  大 鼠 卵 巢 组 织 中 PI3K、Akt、mTOR、GLUT4
          2 方法                                                mRNA表达水平的检测
          2.1 造模、分组与给药                                            采用实时荧光定量 PCR 法进行检测。取卵巢组织
              取大鼠50只，适应性饲养1周后，按1 mg/kg灌胃来                     100 mg，加入TriQuick试剂1 mL充分研磨匀浆后提取总
          曲唑混悬液造模，每天1次，连续21 d，造模第16天开始                        RNA，并检测总 RNA 浓度及纯度。取总 RNA 适量，在
          进行阴道涂片检测，当光镜下可见阴道上皮细胞持续角                            20 μL反应体系内合成cDNA，再以2 μL cDNA为模板，
                           [11]
          化则表明造模成功 。将造模成功的 50 只大鼠按体质                          加入靶基因上下游引物，于15 μL反应体系内进行PCR
          量随机分为模型组、阳性对照组（炔雌醇环丙孕酮片0.2                          扩增。反应结束后，根据扩增曲线及溶解曲线判断PCR
          mg/kg+盐酸二甲双胍片 230 mg/kg，剂量均为临床等                     反应特异性。以GAPDH为内参，采用2               －ΔΔCt 法计算目的
          效剂量）和补肾强身片低、中、高剂量组（189、378、756                      基因mRNA的表达水平。
          mg/kg，中剂量为临床等效剂量），每组10只。另取10只                       2.7  大鼠卵巢组织中 PI3K、p-Akt、p-mTOR、GLUT4
          未造模大鼠作为正常组。上述各药物均以0.1% CMC-Na                       蛋白表达水平的检测
          制成混悬液后进行灌胃给药，灌胃体积为 10 mL/kg，正                           采用免疫组织化学染色法进行检测。取“2.5”项下
          常组大鼠灌胃等体积 0.1% CMC-Na 溶液，每天给药 1                     各组大鼠剩余的切片，经二甲苯脱蜡、水化后，用柠檬酸
          次，连续30 d。                                           盐缓冲液热修复8 min；待切片温度降至室温后，以H2O2
          2.2 取材及处理                                           孵育10 min，PBS浸洗3次，每次3 min；以山羊血清孵育
              末次灌胃 24 h 后，各组大鼠称体质量后腹腔注射 1                     30 min，然后滴加 PI3K（稀释度为 1∶1 000）、p-Akt（稀释
          g/kg 氨基甲酸乙酯麻醉，腹主动脉取血，血样以 3 000                      度为 1∶100）、p-mTOR（稀释度为 1∶100）、GLUT4（稀释
          r/min 离心 10 min，取上层血清于－80 ℃下保存。取血                   度为1∶400）抗体，4 ℃孵育过夜。次日将切片于37 ℃复
          后，将大鼠处死，剖取卵巢，去除周围组织，以生理盐水                           温 30 min，滴加二抗孵育 20 min，PBS 浸洗 3 次，每次 3
          洗涤后观察卵巢外观形态；以滤纸吸尽卵巢表面液体后                            min；以DAB显色10 min，自来水冲洗终止显色；再以苏
          称质量，然后将卵巢一分为二，其中一份用4%多聚甲醛                           木素复染切片 3 min，经盐酸乙醇分化后，以自来水冲
          固定，另一份用液氮速冻后于－80 ℃下储存。                              洗，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后，采
          2.3  大鼠血清中E2、T、GnRH、FSH、LH水平的检测                     用显微镜进行观察。每张切片在显微镜下随机选取1个
              取“2.2”项下各组大鼠的血清样品，室温融化，按照                       视野，以棕黄色为阳性染色，采用 Image-Pro Plus 6.0 软
          试剂盒说明书方法操作，采用酶标仪于450 nm波长处测                         件测定每个视野中阳性染色区域的积分光密度（inte‐
          定吸光度，并根据标准曲线计算大鼠血清中 E2、T、                           grated optical density，IOD）值，以表示各蛋白的表达
          GnRH、FSH、LH水平。                                      水平。
          2.4  大鼠卵巢系数的计算                                      2.8  统计学方法
              统计各组大鼠卵巢质量与体质量，计算卵巢系数                               数据采用 SPSS 26.0 软件进行统计分析，计量资料
         （卵巢系数＝卵巢质量/体质量），以此来评价卵巢的病变                           均采用 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组
          程度。                                                 间方差齐时两两比较采用 LSD-t 检验，方差不齐时采用
          2.5 大鼠卵巢组织病理形态学观察                                   Dunnett’s检验。检验水准α＝0.05。
              取“2.2”项下固定于4%多聚甲醛的卵巢组织，经梯                       3 结果
          度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（4 μm）后，以                        3.1 大鼠卵巢外观形态的观察结果
          二甲苯脱蜡；取部分切片（其余部分用于免疫组织化学                                正常组大鼠卵巢外观形态正常，呈淡粉色，表面有
          染色），经苏木素-伊红（HE）染色后，以梯度乙醇脱水、中                        不规则结节状卵泡；模型组大鼠卵巢稍增大，颜色稍苍
          性树胶封片，然后于光学显微镜下观察卵巢组织的病理                            白，表面布满小囊，结节状卵泡减少；阳性对照组和补肾
          形态学变化，并根据卵巢囊性病变进行评分：正常记 0                           强身片各剂量组大鼠卵巢病变情况相对模型组较轻。
          分；闭锁及无卵丘的囊性卵泡占卵泡总量的百分比≤                             3.2 大鼠卵巢系数的计算结果
          25% 记 1 分；闭锁及无卵丘的囊性卵泡占卵泡总量的百                            与正常组比较，模型组大鼠卵巢系数显著增加（P＜
          分比在＞25%～＜50% 之间记 2 分；闭锁及无卵丘的囊                       0.05）；与模型组比较，阳性对照组和补肾强肾片各剂量
          性卵泡占卵泡总量的百分比在 50%～＜75% 之间记 3                        组大鼠卵巢系数显著减小（P＜0.05）。结果见表2。


          ·2634·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 21                                 中国药房    2022年第33卷第21期
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