Page 88 - 《中国药房》2022年20期
P. 88

暴露心脏，用5/0丝线于左冠状动脉前降支底部结扎，结                          试剂渗透后，再使用 3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活
          扎时放入特制线栓，以左室前壁发绀和 ST 段抬高为缺                          性。将切片置于 TUNEL 反应混合物 50 µL 中，于 37 ℃
          血成功的标志；缺血30 min后拔去线栓再灌注2 h，若上                       下孵育1 h，以DAB法显色后，使用Image J 1.8.0软件计
          述变化消失，说明再灌注成功 。Sham组、I/R组和I/R+                      算细胞凋亡指数：细胞凋亡指数＝凋亡阳性细胞（呈棕
                                   [10]
          Asp 组大鼠在缺血前 48 h 分别灌胃生理盐水；I/R+Asp+                  色）/细胞总数（呈蓝色）×100%。
          in-miR-340-5p 组和 I/R+Asp+HMGB1 组大鼠在缺血前              2.8 心肌组织中miR-340-5p表达情况检测
          48 h 分别转染 in-miR-340-5p 或过表达 HMGB1（即分别                  采用 qRT-PCR 法进行检测。取“2.2”项下冻存的各
          尾静脉注射含有 in-miR-340-5p 或过表达 HMGB1 的腺                 组大鼠心肌组织适量，匀浆，用 Trizol 试剂盒提取总
          病毒，以 miR-340-5p 或 HMGB1 的表达情况判定是否                   RNA。检测总RNA纯度、浓度和完整度后，参照逆转录
          转染成功）。各药物组大鼠在造模前 7 d 灌胃 Asp 200                     试剂盒说明书将 RNA 逆转录成 cDNA，使用 SYBR Pre‐
          mg/（kg·d）[以生理盐水为溶剂，分 2 次，连续 7 d]，Sham               mix Ex Taq试剂盒以U6作为内参进行PCR扩增。反应
          组、I/R 组平行灌胃等体积生理盐水             [8―9] 。上述过程均经        体系（共 20 µL）包括：上、下游引物各 0.4 µL，2×SYBR
          过首都医科大学附属北京世纪坛医院动物实验伦理委                             Premix Ex Taq 10 µL，cDNA 模板 1 µL，用 ddH2O 补足
          员会批准，严格参照相关规范要求操作 。                                 20 µL。反应程序如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20
                                           [11]
          2.2 血液和心肌组织标本采集                                     s，57 ℃退火 30 s，70 ℃延伸 30 s，共 37 个循环。使用
              再灌注 2 h 后，以 2% 戊巴比妥钠麻醉大鼠，从心脏                    2 －ΔΔCt 法计算待测基因的相对表达量（以 Sham 组为参
          采集血液样本并分离血清。随后，断颈处死大鼠，剖取                            照）。miR-340-5p上游引物为5′-GCGGTTATAAAGCA-
          心脏，用滤纸吸干，称定质量，沿左心室长轴采集心肌组                           ATGAGA-3′，下游引物为 5′-GTGCGTGTCGTGGAGT-
          织，每组随机选取5只大鼠的心肌组织用10%中性甲醛                           CG-3′；内参上游引物为 5′-CTCGCTTCGGCAGCA-
          溶液固定，用于病理观察和细胞凋亡检测；其余15只大                           CA-3′，下游引物为 5′-AACGCTTTCACGAATTTGC-
          鼠的心肌组织于－80 ℃冻存，用于炎症及氧化应激指标                          GT-3′。
         （5 只）、心肌梗死面积（5 只）和 miR-340-5p、HMGB1、                 2.9  心肌组织中HMGB1、TLR4蛋白表达情况检测
          TLR4表达（5只）的检测。                                          采用Western blot法进行检测。取“2.2”项下冻存的
          2.3  血清心肌损伤指标检测                                     各组大鼠心肌组织适量，经裂解液 500 µL 裂解后，于冰
              取“2.2”项下各组大鼠血清样本适量，采用 ELISA                     浴中匀浆，离心取上清液。将所获蛋白与上样缓冲液混
          法以酶标仪检测其血清LDH、CK-MB、cTnⅠ水平，严格                       合，于95 ℃下煮沸15 min变性。取变性蛋白，行电泳分
          按照各试剂盒说明书操作。                                        离并转移到 PVDF 膜上，以 5% 脱脂牛奶封闭，加入
          2.4  心肌组织中炎症和氧化应激指标检测                               HMGB1、TLR4、β-actin 一抗（稀释比例均为 1∶1 000），
              取“2.2”项下冻存的各组大鼠心肌组织适量，经匀                        4 ℃下孵育过夜；洗膜，加入相应二抗（稀释比例为 1∶
          浆、离心后，取上清液，按试剂盒方法以酶标仪检测心肌                           5 000），37 ℃下孵育 1 h，经 ECL 显影后，使用凝胶成像
          组织中 MPO、SOD、GSH-Px、MDA 水平，严格按照各试                    系统成像并计算待测蛋白的相对表达量：待测蛋白的相
          剂盒说明书操作。                                            对表达量＝待测蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。
          2.5  心肌组织病理观察                                       2.10  miR-340-5p与HMGB1靶向关系的验证
              取“2.2”项下固定的各组大鼠心肌组织适量，用石蜡                           体外常规培养H9C2心肌细胞用于验证miR-340-5p
          包埋后切片（厚度5 µm），经脱蜡、水化后，行HE染色并                        与 HMGB1 之间的靶向关系。采用 Targetscan 软件预测
          置于光学显微镜下观察其病理改变。                                    miR-340-5p 与 HMGB1 的结合位点，随后将含有预测结
          2.6 心肌梗死面积检测                                        合 位 点 的 HMGB1 野 生 型（HMGB1 WT）或 突 变 型
              取“2.2”项下冻存的各组大鼠心肌组织适量，切成5                      （HMGB1 MUT）的 3′- 非 翻 译 区（3′-untranslated re‐
          个切片（厚度 3 mm），放入培养皿中，在 37 ℃培养箱中                      gions，3′-UTR）片段克隆在荧光素酶 pmirGLO 载体上，
          温育 10～15 min 后用 1%TTC 试剂染色（缺血性心肌组                   经 DNA 测序验证后，按照 Lipofectamine 2000 转染试剂
          织可被染成红色，而梗死区域仍为灰白色）。用相机拍                            说明书操作，将 HMGB1 WT 或 HMGB1 MUT 与 miR-
          照并采用Image-Pro Plus 6.0软件计算心肌梗死面积：心                  340-5p（miR-340-5p 组）或 miR-NC（miR-NC 组）共同转
          肌梗死面积＝5 个切片梗死面积之和/整个心脏面积×                           染至H9C2心肌细胞，培养48 h后取出，使用酶标仪对荧
          100%。                                               光素酶活性进行测定，并采用 Western blot 法检测单独
          2.7  心肌细胞凋亡情况检测                                     转染过表达miR-340-5p或miR-NC后H9C2心肌细胞中
              采用 TUNEL 法进行检测。取“2.5”项下切片，依次                    HMGB1蛋白的相对表达量（具体操作同“2.9”项），实验
          置于二甲苯中脱蜡、乙醇中水合，通过0.1%Triton X-100                   重复5次。


          ·2510·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 20                                 中国药房    2022年第33卷第20期
   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93