Page 87 - 《中国药房》2022年20期
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心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤是          生物科技有限公司；荧光素酶 pmirGLO 载体（批号
          临床常见疾病。有学者认为，I/R损伤在冠状动脉血流、                         GN1439）购自上海盖宁生物科技公司；Lipofectamine
          心肌缺血恢复和心肌梗死面积缩小等过程中难以避                             2000 转染试剂（批号 11668019）购自美国 Invitrogen 公
            [1]
          免 。近年来，随着各种心脏介入治疗技术的广泛应用，                          司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）酶联免疫
          心血管疾病患者的治愈率虽有较大提高，但由此产生的                           吸附测定（ELISA）试剂盒（批号 RL008）、肌酸激酶同工
                          [2]
          I/R损伤也日益增多 。                                       酶MB（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）ELISA试
              有研究指出，微 RNA（microRNA，miRNA）可作用                 剂盒（批号RC044）均购自上海歌凡生物科技有限公司；
          于心肌I/R损伤，已成为相关研究的重要靶点，如通过提                         心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ）ELISA试剂
          高 miRNA-340-5p（miR-340-5p）表达来改善小鼠心功能               盒（批号 orb158935）购自英国 Biobyt 公司；髓过氧化物
          和心肌病变，抑制心肌酶活性、炎症反应和氧化应激，减                          酶（myeloperoxidase，MPO）试剂盒（比色法，批号 AO44-
                                    [3]
          少细胞凋亡，进而缓解 I/R 损伤 。结合上述研究，本课                       1-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂
          题组借助生物学分析发现，高迁移率族蛋白 1（high mo‐                     盒（WST-1 法，批号 A001-3-1）、谷胱甘肽过氧化物酶
          bility group box 1，HMGB1）可 能 是 miR-340-5p 的 靶     （glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒（比色法，批号
            [4]
          点 。既往研究表明，HMGB1是一种普遍存在且含量丰                         A005-1-1）、丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）试 剂 盒
                                                     [5]
          富的核蛋白，在多种心血管疾病中均有关键作用 ；此                          （TBA法，批号A003-1-1）均购自南京建成生物工程研究
          外，HMGB1 被鉴定为内源性 Toll 样受体 4（Toll-like re‐           所；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（批号 AG1120）、
          ceptors 4，TLR4）的配体，下调 HMGB1/TLR4 信号通路              TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（批号AT2190）均购自上海
                                          [6]
          可有效减轻 I/R 诱导的心肌细胞损伤 。由此本课题组                        吉至生化科技有限公司；TTC 染液（批号 YT8072）、Tri‐
          推测，miR-340-5p 缓解 I/R 损伤可能与下调 HMGB1/                ton X-100试剂（批号SY5134）均购自北京伊塔生物科技
          TLR4信号通路有关。                                        有限公司；逆转录试剂盒（批号YST0010）购自桂林金优
              阿司匹林（aspirin，Asp）是心血管疾病二级预防的                   胜特贸易有限公司；SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（批号
          主要药物，可参与调控HMGB1、TLR4等蛋白的表达，并                       DRR041A）购自日本 TAKARA 公司；高效 RIPA 组织/细
          可通过减轻心肌 I/R 损伤来发挥心脏保护作用                 [7―9] 。然   胞快速裂解液（批号 R0010）、Trizol 试剂盒（批号 15596-
          而，Asp在心肌I/R损伤中的调控机制尚不明确，其干预                        018）、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（批号D0010）均
          作用是否与miR-340-5p/HMGB1/TLR4信号通路有关仍                  购自北京索莱宝科技有限公司；兔 HMGB1 多克隆抗体
          不清楚。为此，本研究通过构建大鼠 I/R 模型来深入探                       （批号 ab18256）、兔 TLR4 多克隆抗体（批号 ab218987）、
          究 Asp 对心肌 I/R 损伤的保护作用及相关机制，以期为                     兔 β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（批号 ab5694）、兔辣
          临床心肌I/R损伤的治疗提供新的参考依据。                              根过氧化物酶标记的 IgG 二抗（批号 ab205718）均购自
          1 材料                                               英国 Abcam 公司；ECL 化学发光试剂盒（批号 P0018S）
          1.1  主要仪器                                          购自上海碧云天生物技术公司；其余试剂均为分析纯，
              ALC-V8S 型动物呼吸机购自上海奥尔科特生物科                      水为纯化水。
          技有限公司；MedLab-U/4C501H型生物信号采集处理系                    1.3  实验动物与细胞
          统购自南京美易科技有限公司；Multiskan FC型酶标仪、                        SPF 级雄性 SD 大鼠 100 只，体质量为 200～250 g，
          BB15 型 CO2 细 胞 培 养 箱 均 购 自 美 国 Thermo Fisher       由中国科学院上海药物研究所提供，动物生产许可证号
          Scientific 公司；7500 型定量逆转录聚合酶链反应（quan‐              为SCXK（沪）2020-0005。大鼠心肌细胞H9C2购自美国
          titative reverse transcriptase-mediated PCR，qRT-PCR）仪  ATCC公司，批号为ZB031。
          购自美国 ABI 公司；Quantity One 型凝胶成像系统、                  2 方法
          1658033 型凝胶电泳系统均购自美国 Bio-Rad 公司；                   2.1 分组、造模与给药
          CKX53型光学显微镜购自日本Olympus公司；ZHS1220                       所有大鼠均被饲养于（25±1）℃、12 h/12 h 光照/黑
          型相机购自日本 Cannon 公司；DU800 型紫外分光光度                    暗交替的恒温空调房内，自由进食，饮水。1 周后，将大
          计购自美国Beckman Coulter公司。                            鼠分为假手术（Sham）组、I/R 组、Asp 预处理（I/R+Asp）
          1.2  主要药品与试剂                                       组、I/R+Asp+in-miR-340-5p 组和 I/R+Asp+HMGB1 组，
              Asp对照品（批号A1189，纯度≥98.0%）购自北京康                  每组 20 只。Sham 组大鼠开胸后不结扎冠状动脉，其余
          瑞纳生物科技有限公司；miR-340-5p 抑制物（in-miR-                  各组大鼠按下法建立模型：经2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）
          340-5p）、过表达 HMGB1、过表达 miR-340-5p 及其阴性              麻醉后以仰卧位固定，插入气管导管并连接呼吸机；分
          对照（miR-NC）均购自生工生物工程（上海）股份有限公                       离大鼠右颈动脉，插入动脉插管并连接到生物信号采集
          司；腺病毒表达载体pacAd5 CMV-GFP购自北京华越洋                     处理系统；切开大鼠胸部，沿胸骨左侧切开，分离心包，


          中国药房    2022年第33卷第20期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 20  ·2509·
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