Page 69 - 《中国药房》2022年20期
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2 方法                                               2.5 细胞增殖能力的检测
          2.1 柴胡陷胸汤的制备                                           采用 MTT 法进行检测。将 ECV304 细胞以 5 000
              分别称取组方药材柴胡 10 g、法半夏 10 g、黄芩 10                 个/孔接种在 96 孔板中，按照“2.3”项下方法分组、处理、
          g、黄连4 g、瓜蒌10 g、木香6 g、九香虫6 g、丹参15 g、甘               培养。24 h 后，每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液 10 μL，
          草6 g，加8倍量的水充分浸泡30 min，煎煮1 h×2次，过                   继续孵育 4 h；然后，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜
          滤，合并 2 次提取液，煎煮浓缩得柴胡陷胸汤药液（每 1                       150 μL，使用酶标仪在490 nm波长处检测各孔的光密度
          mL相当于生药2.0 g）。                                    （optical density，OD）值。以培养基为空白孔，按下式计
          2.2 正常血清和高脂血清的制备                                   算细胞增殖率：细胞增殖率＝（实验组 OD 值－空白孔
              将12只新西兰兔随机分为正常组和高脂血症组，每
                                                             OD值）/（对照组OD值－空白孔OD值）×100%。
                                  [13]
          组 6 只。参考相关文献方法 ，正常组兔给予普通饲料
                                                             2.6 细胞中炎症因子和血管内皮功能指标的检测
          喂养，高脂血症组兔给予1%高脂饲料（含胆固醇1 g、猪
                                                                 采用酶联免疫吸附测定法进行检测。收集“2.5”项
          油 5 g、蛋黄粉 15 g，其余为普通饲料）喂养，每天约 100
                                                             下各组细胞的上清液，按相应试剂盒说明书操作，使用
          g，连续喂养12周。第13周，各组兔经麻醉后，于腹主动
                                                             酶标仪检测各组细胞上清液中炎症因子（TNF-α、IL-6）
          脉采血 40 mL，使用全自动生化分析仪检测其血清中三
                                                             和血管内皮功能指标（eNOS、NO、ET-1）水平。
          酰甘油（triacylglycerol，TG）、总胆固醇（total cholesterol，
                                                             2.7 细胞中ICAM-1、TGF-β1 mRNA表达的检测
          TC）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）和高
                                                                 采用荧光定量PCR法进行检测。收集“2.5”项下各
          密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）水平，若 TC
                                                      [14]
          水平高于正常组 3 倍则表示高脂血症模型复制成功 。                         组细胞，采用 Trizol 试剂提取其总 RNA，并反转录为
          检测结果显示，正常组兔血清中 TG、TC、LDL、HDL 水                     cDNA，以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。反应体系（20
          平 分 别 为（1.25±0.13）、（1.67±0.21）、（1.85±0.13）         μL）包含：SYBR Green Mix（10 μL）、无菌双蒸水（7.4
         （1.34±0.15）mmol/L，高脂血症组兔上述指标分别为                     μL）、上游引物（0.8 μL）、下游引物（0.8 μL）和 cDNA 模
         （2.48±0.19）、（7.14±0.28）、（5.93±0.16）、（0.65±0.11）     板（1.0 μL）。反应条件如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变
          mmol/L。可见，高脂血症组兔血清 TC 水平约为正常组                      性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。以
          的 4.3 倍，表明高脂血症模型复制成功。收集兔血清                         GAPDH 为内参，采用 2       －ΔΔCt  法计算目标 mRNA 表达水
          于－80 ℃冰箱中保存，备用。                                    平，以各组细胞中 ICAM-1、TGF-β1 mRNA 的表达水平
          2.3  柴胡陷胸汤含药血清的制备                                  与对照组的比值作为评价结果。
              将 24 只大鼠随机分为空白组和柴胡陷胸汤低、中、                      2.8  细胞中TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达的检测
          高剂量组，每组6只。按照人（体质量70 kg）与大鼠体表
                                                                 采用Western blot法进行检测。收集“2.5”项下各组
          面积换算公式，以人等效剂量的 6.3 倍换算得柴胡陷胸                        细胞，采用 RIPA 裂解液提取其总蛋白，测定浓度后，加
          汤中剂量为 6.94 g/kg（以生药量计，下同），同时设置该
                                                             热变性。取变性蛋白，经电泳分离后转移至聚偏二氟乙
          方低、高剂量分别为3.47、13.88 g/kg。各组大鼠每天早、
                                                             烯膜上，用 5% 脱脂奶粉封闭 1 h，分别加入兔源 TLR4、
          晚灌胃相应剂量的药液1次，空白组灌胃等量生理盐水，
                                                             NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、β-actin一抗（除
          连续给药7 d。末次给药1 h后，大鼠经戊巴比妥钠麻醉
                                                             β-actin 的稀释比例为 1∶2 000 外，其余均为 1∶1 000），
          后，于腹主动脉取血，分离血清，于 56 ℃水浴灭活 30
                                                             4 ℃孵育过夜；洗涤 3 次后，加入二抗（稀释比例为 1∶
          min，再于－80 ℃冰箱中保存，备用。
                                                             5 000），室温孵育 1 h；洗涤后，使用化学发光试剂显
          2.4  细胞分组与处理
                                                             影，并采用Image J V1.8.0软件分析各条带的灰度值，以
              将ECV304细胞接种于DMEM培养基中，分为对照
                                                             β-actin 为内参，计算目标蛋白的相对表达量，并计算
          组、模型组和柴胡陷胸汤低、中、高浓度组，每组设3个复
          孔。在预实验结果的基础上，对照组细胞用含20%正常                          p-NF-κB p65/NF-κB p65比值。
          兔血清的 DMEM 培养基培养，其余各组细胞用含 20%                       2.9 统计学分析
          高脂兔血清的 DMEM 培养基培养；24 h 后，对照组和模                         采用 GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计分
          型组细胞用含20%正常大鼠血清的DMEM培养基继续                          析。实验数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差
          培养24 h，柴胡陷胸汤低、中、高浓度组细胞用含20%含                       分 析 ，组 间 两 两 比 较 采 用 SNK-q 检 验 。 检 验 水 准
          药大鼠血清的DMEM培养基继续培养24 h。                             α＝0.05。


          中国药房    2022年第33卷第20期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 20  ·2495·
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